タイの地元の食品加工工場で蚊の駆除効果を検証した以前のプロジェクトでは、カヤツリグサ、ガランガル、シナモンの精油（EO）がネッタイシマカに対して優れた抗蚊作用を持つことが分かりました。伝統的な殺虫剤の使用を減らす試みとして、殺虫剤本研究では、耐性蚊の個体群制御を改善するために、エチレンオキシドの成虫駆除効果と、ピレスロイド耐性および感受性株を含むネッタイシマカに対するペルメトリンの毒性との間の潜在的な相乗効果を特定することを目的とした。
C. rotundusおよびA. galangaの根茎、ならびにC. verumの樹皮から抽出したEOの化学組成と、感受性株Muang Chiang Mai（MCM-S）および耐性株Pang Mai Dang（PMD-R）に対する殺虫活性を評価する。）活性型Ae. Aedes aegyptiの成虫に対するEO-ペルメトリン混合物のバイオアッセイも実施し、その相乗効果を解明した。Aedes aegypti株。
GC-MS分析法を用いた化学特性解析の結果、C. rotundus、A. galanga、C. verumのEOから48の化合物が同定され、それぞれ全成分の80.22%、86.75%、97.24%を占めました。シペラス油、ガランガル油、バルサミコ油の主成分は、それぞれシペレン（14.04%）、β-ビサボレン（18.27%）、シナマルデヒド（64.66%）です。生物学的成虫殺虫試験において、C. rotundus、A. galanga、C. verumのEVはAe. spp.の殺虫に効果的でした。ネッタイシマカ、MCM-SおよびPMD-RのLD50値は、それぞれ10.05および9.57μg/mg雌、7.97および7.94μg/mg雌、3.30および3.22μg/mg雌でした。MCM-SおよびPMD-R Aeのネッタイシマカ成虫の殺虫効率は、ピペロニルブトキシド（PBO値、LD50 = それぞれ6.30および4.79μg/mg雌）に近かったが、ペルメトリン（LD50値 = それぞれ0.44および3.70 ng/mg雌）ほど顕著ではありませんでした。しかし、組み合わせバイオアッセイでは、EOとペルメトリンの間に相乗効果があることがわかりました。2種類のシマカ属蚊に対してペルメトリンとの顕著な相乗効果がありました。 C. rotundusおよびA. galangaのEMにおいて、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）が確認されました。C. rotundusおよびA. galangaの精油を添加すると、MCM-SにおけるペルメトリンのLD50値がそれぞれ0.44 ng/mgから0.07 ng/mg、雌で0.11 ng/mgへと有意に減少し、相乗効果比（SR）はそれぞれ6.28および4.00でした。さらに、C. rotundusおよびA. galangaのEOは、PMD-RにおけるペルメトリンのLD50値をそれぞれ3.70 ng/mgから0.42 ng/mg、雌で0.003 ng/mgへと有意に減少させ、SRはそれぞれ8.81および1233.33でした。
エチレンオキシドとペルメトリンの組み合わせによる相乗効果は、2種類のネッタイシマカ（Aedes aegypti）に対する成虫毒性を高めます。ネッタイシマカは、特に従来の薬剤が効果を発揮しない、または不適切な場合に、エチレンオキシドが相乗剤として蚊の駆除効果を高める有望な役割を果たすことを示しています。
ネッタイシマカ（双翅目：カ科）はデング熱や黄熱病、チクングニア熱、ジカウイルスなどの他の感染性ウイルス性疾患の主な媒介生物であり、人類に対して甚大かつ永続的な脅威となっている[1, 2]。デング熱ウイルスはヒトに影響を及ぼす最も重篤な病原性出血熱であり、年間500万～1億人が発症し、世界中で25億人以上が感染のリスクにさらされていると推定されている[3]。この感染症の発生は、ほとんどの熱帯諸国の人口、医療制度、経済に大きな負担をかけている[1]。タイ保健省によると、2015年には全国で142,925人のデング熱症例と141人の死亡が報告されており、これは2014年の症例数および死亡者数の3倍以上である[4]。歴史的証拠に反して、デング熱はネッタイシマカによって根絶されたか、大幅に減少した。ネッタイシマカ[5]の駆除後、数十年にわたる地球温暖化もあって感染率が劇的に上昇し、世界中に病気が広がりました。ネッタイシマカは日中に人家やその周辺で交尾、摂食、休息、産卵を行う国内媒介蚊であるため、その駆除と制御は比較的困難です。さらに、この蚊は自然現象（干ばつなど）や人による制御措置による環境の変化や撹乱に適応する能力があり、個体数が元に戻ることがあります[6, 7]。デング熱ワクチンはつい最近承認されたばかりで、デング熱に対する特別な治療法がないため、デング熱の感染リスクの予防と軽減は、媒介蚊を制御し、媒介蚊と人との接触を排除することに完全に依存しています。
特に、蚊の駆除のための化学物質の使用は、現在、包括的な総合的媒介生物管理の重要な要素として、公衆衛生において重要な役割を果たしています。最も一般的な化学的方法には、蚊の幼虫（幼虫駆除剤）と成虫（蚊の成虫）に作用する低毒性の殺虫剤の使用があります。発生源の削減と有機リン系殺虫剤や昆虫成長調整剤などの化学幼虫駆除剤の定期的な使用による幼虫駆除は重要と考えられています。しかし、合成殺虫剤に関連する環境への悪影響と、労働集約的で複雑な維持管理は、依然として大きな懸念事項です[8, 9]。成虫駆除などの伝統的な積極的媒介生物防除は、感染症媒介生物を迅速かつ大規模に根絶し、地域の媒介生物個体群の寿命と寿命を短縮できるため、ウイルスの発生時に最も効果的な防除手段です[3]。、10]。化学殺虫剤には、有機塩素系（DDTと略す）、有機リン系、カーバメート系、ピレスロイド系の4種類があり、これらが媒介生物防除プログラムの基盤となっています。ピレスロイド系は最も効果的な殺虫剤と考えられています。ピレスロイド系は様々な節足動物に対して高い効果を発揮しますが、哺乳類に対する毒性は低いです。現在、合成ピレスロイド系が市販殺虫剤の大部分を占め、世界の殺虫剤市場の約25%を占めています[11, 12]。ペルメトリンとデルタメトリンは、広範囲に作用するピレスロイド系殺虫剤で、数十年にわたり世界中で、農業および医療上重要な様々な害虫の防除に使用されてきました[13, 14]。1950年代には、タイの国家公衆衛生蚊防除プログラムにおいて、DDTが選定されました。マラリア流行地域でDDTが広く使用されていたことを受けて、タイは1995年から2000年の間にDDTの使用を段階的に廃止し、ペルメトリンとデルタメトリンという2種類のピレスロイドに置き換えました[15, 16]。これらのピレスロイド系殺虫剤は、主に蚊帳処理、熱霧、超低毒性スプレーの使用を通じて、マラリアとデング熱を制御するために1990年代初頭に導入されました[14, 17]。しかし、蚊の強い抵抗性と、合成化学物質の公衆衛生と環境への影響に対する懸念から国民が遵守しなかったために、効果を失っています。これは、脅威ベクター制御プログラムの成功に大きな課題をもたらします[14, 18, 19]。戦略をより効果的にするためには、タイムリーで適切な対策が必要です。推奨される管理手法としては、天然物質の代替、異なる種類の化学物質のローテーション、共力剤の添加、異なる種類の化学物質の混合または同時使用などが挙げられる[14, 20, 21]。したがって、環境に優しく、簡便かつ効果的な代替物質および共力剤の発見と開発が緊急に必要とされており、本研究はこうしたニーズに応えることを目的としている。
天然由来の殺虫剤、特に植物成分をベースとした殺虫剤は、現在および将来の蚊駆除の代替手段の評価において可能性を示しています[22, 23, 24]。いくつかの研究では、植物由来製品、特に精油（EO）を成虫駆除剤として使用することで、重要な媒介蚊を駆除できることが示されています。セロリ、クミン、ガジュツ、アニス、パイプペッパー、タイム、シナス・テレビンティフォリア（Schinus terebinthifolia）、シトラス（Cymbopogon citratus）、シトラス（Cymbopogon schoenanthus）、ギガンテウス（Cymbopogon giganteus）、アカザ（Chenopodium ambrosioides）、プランコニ（Cochlospermum planchonii）、ユーカリ（Eucalyptus ter eticornis）など、多くの植物油に、いくつかの重要な蚊種に対する殺虫特性が認められています。 、ユーカリ・シトリオドラ、カナンガ・オドラータ、ペトロセリナム・クリスカム [25,26,27,28,29,30] など。エチレンオキシドは現在、単独で使用されるだけでなく、抽出された植物物質または既存の合成殺虫剤と組み合わせて使用され、さまざまなレベルの毒性を生み出します。有機リン系、カーバメート系、ピレスロイド系などの従来の殺虫剤とエチレンオキシド/植物抽出物の組み合わせは、毒性効果が相乗的または拮抗的に作用し、病原体媒介昆虫や害虫に対して有効であることが示されている [31,32,33,34,35]。しかし、合成化学物質の有無にかかわらず、植物化学物質の組み合わせの相乗毒性効果に関するほとんどの研究は、医学的に重要な蚊ではなく、農業用昆虫媒介生物および害虫を対象に実施されています。さらに、植物と合成殺虫剤の組み合わせによる蚊媒介に対する相乗効果に関する研究のほとんどは、幼虫駆除効果に焦点を当てています。
著者らは、タイ在来の食用植物から殺虫剤をスクリーニングする進行中の研究プロジェクトの一環として、以前、Cyperus rotundus、ガランガル、シナモンからエチレンオキシドがネッタイシマカの成虫に対して潜在的な活性を持つと報告している [36]。したがって、本研究では、これらの薬用植物から単離されたEOの、ピレスロイド耐性および感受性株を含むネッタイシマカに対する有効性を評価することを目的とした。成虫に対して良好な効果を示すエチレンオキシドと合成ピレスロイドの2成分混合物の相乗効果も分析されており、これは従来の殺虫剤の使用を減らし、特にネッタイシマカに対する蚊媒介生物への耐性を高めることが期待される。本稿では、効果的な精油の化学的特性評価と、合成ペルメトリンのネッタイシマカに対する毒性を高める可能性について報告する。ピレスロイド感受性株 (MCM-S) と耐性株 (PMD-R) のネッタイシマカ。
精油抽出に使用したC. rotundusおよびA. galangaの根茎、ならびにC. verumの樹皮（図1）は、タイ国チェンマイ県の生薬供給業者から購入しました。これらの植物の科学的同定は、タイ国チェンマイ県チェンマイ大学（CMU）理学部生物学科植物標本学者のジェームズ・フランクリン・マクスウェル氏、およびカーネギーメロン大学薬学部薬学科の科学者ワンナリ・チャロエンサップ氏との協議に基づいて行われました。各植物のバウチャー標本は、将来の使用に備えてカーネギーメロン大学医学部寄生虫学教室に保管されています。
植物サンプルは、天然エッセンシャルオイル（EO）の抽出前に水分を除去するため、周囲温度が約30 ± 5 °Cで、換気のよい開放空間で3～5日間個別に日陰乾燥させた。乾燥植物材料250 gを機械的に粗粉末に粉砕し、水蒸気蒸留によってエッセンシャルオイル（EO）を単離した。蒸留装置は、電熱マントル、3000 mL丸底フラスコ、抽出カラム、コンデンサー、クールエース装置（Eyela Cool Ace CA-1112 CE、東京理化器械株式会社、東京、日本）で構成されていた。フラスコに蒸留水1600 mlとガラスビーズ10～15個を加え、電気ヒーターを使用して蒸留が完了してEOが生成されなくなるまで少なくとも3時間、約100°Cに加熱した。 EO層は分液漏斗を使用して水相から分離され、無水硫酸ナトリウム（Na2SO4）で乾燥され、化学組成と成虫の活性が検査されるまで4°Cで密封された茶色の瓶に保存されました。
精油の化学組成は、成体物質の生物学的検定と同時に実施しました。定性分析は、シングル四重極質量選択検出器（Agilent Technologies、米国カリフォルニア州ウィルミントン）を搭載したHewlett-Packard社（米国カリフォルニア州ウィルミントン）製7890AガスクロマトグラフとMSD 5975C（EI）（Agilent Technologies）で構成されるGC-MSシステムを用いて実施しました。
クロマトグラフィーカラム – DB-5MS（30 m × ID 0.25 mm × フィルム厚 0.25 µm）。GC-MS の総実行時間は 20 分でした。分析条件は、インジェクターとトランスファーラインの温度がそれぞれ 250 と 280 °C です。炉の温度は 50 °C から 250 °C まで 10 °C/分の速度で上昇するように設定され、キャリアガスはヘリウム、流量は 1.0 ml/分、注入量は 0.2 µL（CH2Cl2 で 1/10 容量%、スプリット比 100:1）です。GC-MS 検出には、イオン化エネルギー 70 eV の電子イオン化システムを使用します。取得範囲は 50～550 原子質量単位（amu）で、スキャン速度は 2.91 スキャン/秒です。 EO成分の同定は、その保持指数（RI）に基づいて行われます。RIは、n-アルカン（C8-C40）についてVan den DoolとKratzの式[37]を用いて算出し、文献[38]およびライブラリデータベース（NIST 2008およびWiley 8NO8）の保持指数と比較しました。表示されている化合物の構造や分子式などの同一性は、入手可能な標準サンプルとの比較によって確認されました。
合成ペルメトリンおよびピペロニルブトキシド（PBO、相乗効果試験における陽性対照）の分析標準物質は、シグマアルドリッチ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入しました。世界保健機関（WHO）の成人用検査キットおよび診断用量のペルメトリン含浸紙（0.75%）は、マレーシア・ペナンのWHOベクターコントロールセンターから購入しました。その他の化学薬品および試薬はすべて分析グレードであり、タイ・チェンマイ県の現地機関から購入しました。
成虫生物学的検定で試験生物として使用した蚊は、感受性ムアンチェンマイ株（MCM-S）と耐性パンマイダン株（PMD-R）を含む、自由に交配する実験用ネッタイシマカ（Aedes mosquitos. aegypti）であった。株MCM-Sは、タイ国チェンマイ県ムアンチェンマイ地域で採取された現地サンプルから得られ、1995年以来CMU医学部寄生虫学科の昆虫学室で維持されている[39]。ペルメトリンに耐性であることがわかったPMD-R株は、もともとタイ国チェンマイ県メータン郡バンパンマイダンで採取された野外蚊から分離され、1997年以来同研究所で維持されている[40]。 PMD-R株は、WHO検出キットに若干の改変を加えて[41]、0.75%ペルメトリンに断続的に曝露することにより、耐性レベルを維持する選択圧下で培養された。Ae. Aedes aegyptiの各株は、病原体フリーの実験室で、25 ± 2 °C、80 ± 10%相対湿度、14:10時間の明暗周期で個別にコロニー化された。約200匹の幼虫を、水道水を満たしたプラスチックトレイ（長さ33 cm、幅28 cm、高さ9 cm）にトレイあたり150～200匹の密度で飼育し、1日2回、滅菌した犬用ビスケットを与えた。成虫は湿潤したケージに入れ、10%ショ糖水溶液と10%マルチビタミンシロップ溶液を継続的に与えた。吸血されていない生後 2 ～ 5 日の雌は、成体実験の生物学的検定に継続して使用することができます。
EOの用量-死亡率反応生物学的検定を、WHOの感受性試験標準プロトコル[42]に従って改変した局所法を用いて、ネッタイシマカ（Aedes mosquito）、ネッタイシマカ、MCM-S、およびPMD-Rの成虫雌に対して実施した。各植物からのEOを適切な溶媒（エタノールまたはアセトンなど）で段階希釈し、4～6段階の濃度系列を作成した。二酸化炭素（CO2）で蚊を麻酔した後、個別に体重を測定した。麻酔した蚊は、処置中の再活性化を防ぐため、実体顕微鏡下で特製コールドプレート上の乾燥ろ紙の上で動かないようにした。各処理ごとに、ハミルトンハンドヘルドマイクロディスペンサー（700シリーズマイクロリットル™、ハミルトン社、米国ネバダ州リノ）を使用して、EO溶液0.1μlを雌の上部前胸背板に塗布した。 25匹の雌に各濃度の処理を施し、少なくとも4つの異なる濃度で死亡率は10%から95%の範囲でした。溶媒で処理した蚊は対照群として使用しました。試験サンプルの汚染を防ぐため、試験したEOごとにろ紙を新しいろ紙に交換してください。これらの生物学的試験で使用する用量は、生きた雌の体重1ミリグラムあたりのEOマイクログラムで表します。成虫のPBO活性もEOと同様の方法で評価し、PBOは相乗実験における陽性対照として使用しました。すべてのグループの処理済み蚊をプラスチックカップに入れ、10%のショ糖と10%のマルチビタミンシロップを与えました。すべての生物学的試験は25 ± 2 °C、80 ± 10%の相対湿度で実施し、対照群を用いて4回繰り返しました。 24時間飼育期間中の死亡率は、蚊が機械的刺激に反応しないことで確認され、4回の反復実験の平均値に基づいて記録された。実験は、各試験サンプルについて異なるバッチの蚊を用いて4回繰り返した。結果をまとめ、死亡率（％）を算出し、プロビット分析によって24時間致死量を決定した。
EOとペルメトリンの相乗的な殺虫効果は、以前に記載した局所毒性試験法[42]を使用して評価した。アセトンまたはエタノールを溶媒として使用して、目的の濃度のペルメトリン、およびEOとペルメトリンの2成分混合物（EO-ペルメトリン：LD25濃度のEOと混合したペルメトリン）を調製した。試験キット（ペルメトリンおよびEO-ペルメトリン）を、Ae. Aedes aegyptiのMCM-S株およびPMD-R株に対して評価した。成虫を殺す効果を試験するため、25匹の雌蚊それぞれにペルメトリンを4回投与し、各投与を4回繰り返した。候補となるEO相乗剤を同定するため、25匹の雌蚊それぞれにEO-ペルメトリンを4～6回投与し、各投与を4回繰り返した。PBO-ペルメトリン処理（LD25濃度のPBOと混合したペルメトリン）も陽性対照として機能した。これらの生物学的試験で使用される用量は、生きた雌の体重1ミリグラムあたりの試験サンプルのナノグラム数で表されます。各蚊の系統について、個別に飼育したバッチで4回の実験評価を実施し、死亡率データを統合してProbitを用いて分析し、24時間致死量を算出しました。
死亡率はアボットの式[43]を用いて調整された。調整されたデータは、コンピュータ統計プログラムSPSS（バージョン19.0）を用いたプロビット回帰分析によって分析された。25%、50%、90%、95%、99%（それぞれLD25、LD50、LD90、LD95、LD99）の致死値は、対応する95%信頼区間（95% CI）を用いて計算された。試験サンプル間の有意差および差異の測定は、各生物学的検定においてカイ二乗検定またはマン・ホイットニーU検定を用いて評価された。結果はPにおいて統計的に有意であると判断された。< 0.05。抵抗係数（RR）は、LD50レベルで次の式を使用して推定されます[12]。
RR > 1は耐性を示し、RR ≤ 1は感受性を示す。各相乗剤候補の相乗比（SR）値は以下のように計算される[34, 35, 44]。
この係数により、結果は3つのカテゴリーに分類されます。SR値が1±0.05の場合は明らかな効果がないと見なされ、SR値が1.05を超える場合は相乗効果があると見なされ、SR値が0.5の場合は効果がないと判断されます。淡黄色の液体オイルは、C. rotundusとA. galangaの根茎とC. verumの樹皮を水蒸気蒸留することで得られます。乾燥重量で計算された収量は、それぞれ0.15%、0.27% (w/w)、0.54% (v/v)でした（表1）。C. rotundus、A. galanga、C. verumのオイルの化学組成をGC-MSで調べたところ、19、17、21の化合物が存在し、それぞれ全成分の80.22、86.75、97.24%を占めました（表2）。 C. lucidum 根茎油の成分は、主にシペロネン（14.04%）で構成され、次いでカラレン（9.57%）、α-カプセラン（7.97%）、α-カプセラン（7.53%）となっています。ガランガル根茎油の主成分はβ-ビサボレン（18.27%）で、次いでα-ベルガモテン（16.28%）、1,8-シネオール（10.17%）、ピペロノール（10.09%）となっています。C. verum 樹皮油の主成分はシナマルデヒド（64.66%）と特定され、酢酸桂皮（6.61%）、α-コパエン（5.83%）、3-フェニルプロピオンアルデヒド（4.09%）が微量成分とされています。シペルン、β-ビサボレン、シナマルデヒドの化学構造は、それぞれ C. rotundus、A. galanga、C. verum の主成分です（図 2 を参照）。
3 つの OO の結果は、Aedes 蚊に対する成虫の活性を評価しました。 aedes aegypti 蚊に対する成虫の活性を表 3 に示します。すべての EO は、さまざまなタイプと用量で MCM-S Aedes 蚊に致死効果があることがわかりました。 Aedes aegypti。最も効果的な EO は C. verum で、次に A. galanga と C. rotundus の LD50 値がそれぞれ 3.30、7.97、10.05 μg/mg MCM-S の雌であり、女性における 3.22 (U = 1)、Z = -0.775、P = 0.667)、7.94 (U = 2、Z = 0、P = 1)、9.57 (U = 0、Z = -1.549、P = 0.333) μg/mg PMD-R よりわずかに高かったです。これは、PBOがMSM-S株よりもPMD-Rに対する成虫効果をわずかに高く持ち、LD50値がそれぞれ4.79μg/mg雌と6.30μg/mg雌であることに対応しています（U = 0、Z = -2.021、P = 0.057）。PMD-Rに対するC. verum、A. galanga、C. rotundus、PBOのLD50値は、MCM-Sに対する値よりもそれぞれ約0.98倍、0.99倍、0.95倍、0.76倍低いと計算できます。したがって、これはPBOとEOに対する感受性が2つのAedes株間で比較的同様であることを示しています。PMD-RはMCM-Sよりも感受性が高かったが、Aedes aegyptiの感受性は有意ではありませんでした。対照的に、2つのAedes株はペルメトリンに対する感受性が大きく異なりました。ネッタイシマカ（表4）において、PMD-Rはペルメトリンに対して顕著な耐性を示した（LD50値：女性で0.44 ng/mg）。MCM-S（LD50値：女性で0.44 ng/mg）と比較して、PMD-RのLD50値は3.70と高かった（U = 0, Z = -2.309, P = 0.029）。PMD-RはMCM-Sに比べてペルメトリンに対する感受性がはるかに低いが、PBOおよびC. verum、A. galanga、C. rotundusの油に対する感受性はMCM-Sよりもわずかに高い。
EO-ペルメトリン併用による成虫集団バイオアッセイで観察されたように、ペルメトリンとEOの2元混合物（LD25）は、相乗効果（SR値 > 1.05）または効果なし（SR値 = 1 ± 0.05）のいずれかを示した。EO-ペルメトリン混合物が実験用アルビノ蚊の成虫に及ぼす複合的な影響。ネッタイシマカ（Aedes aegypti）のMCM-S株とPMD-R株を表4と図3に示す。C. verum油を添加すると、MCM-Sに対するペルメトリンのLD50がわずかに減少し、PMD-Rに対するLD50が女性でそれぞれ0.44～0.42 ng/mg、3.70～3.85 ng/mgにわずかに増加することが判明した。対照的に、C. rotundusおよびA. galangaオイルの添加は、MCM-SにおけるペルメトリンのLD50を0.44から0.07（U = 0、Z = -2.309、P = 0.029）、および0.11（U = 0）に有意に減少させた。MCM-SのLD50値に基づくと、C. rotundusおよびA. galangaオイル添加後のEO-ペルメトリン混合物のSR値は、それぞれ6.28および4.00であった。その結果、PMD-Rに対するペルメトリンのLD50は、3.70から0.42（U = 0、Z = -2.309、P = 0.029）に有意に減少し、C. rotundusおよびA. galangaのオイルを添加すると0.003（U = 0）に減少しました。、Z = -2.337、P = 0.029）ng/mg雌。C. rotundusと組み合わせたペルメトリンのPMD-Rに対するSR値は8.81であったのに対し、ガランガルとペルメトリン混合物のSR値は1233.33でした。 MCM-S株と比較して、陽性対照であるPBOのLD50値は、雌では0.44 ng/mgから0.26 ng/mgに、雌では3.70 ng/mgから0.65 ng/mgに減少しました（U = 0, Z = -2.309, P = 0.029）。PMD-R株では、PBOとペルメトリンとの混合物のSR値はそれぞれ1.69と5.69でした。これらの結果は、MCM-S株とPMD-R株において、C. rotundusおよびA. galangaの油とPBOがC. verum油よりもペルメトリン毒性を増強することを示しています。
EO、PBO、ペルメトリン（PE）およびそれらの組み合わせによる、ピレスロイド感受性（MCM-S）および耐性（PMD-R）のネッタイシマカ（Aedes aegypti）に対する成虫に対する活性（LD50）。
[45]。合成ピレスロイドは、農業や医療上重要なほぼすべての節足動物を防除するために世界中で使用されています。しかし、合成殺虫剤の使用による有害な結果、特に蚊の耐性の発達と広範な耐性、および長期的な健康と環境への影響のために、現在、従来の合成殺虫剤の使用を減らし、代替品を開発することが急務となっています[35, 46, 47]。環境と人間の健康を保護することに加えて、植物性殺虫剤の利点には、高い選択性、世界的な入手可能性、および製造と使用の容易さなどがあり、蚊の防除にとってより魅力的になっています[32,48, 49]。本研究では、GC-MS分析により効果的な精油の化学的特性を解明することに加えて、成虫精油の効力と合成ペルメトリンの毒性を高める能力も評価しました。ピレスロイド感受性株 (MCM-S) と耐性株 (PMD-R) のネッタイシマカ。
GC-MSによる特性解析の結果、C. rotundus、A. galanga、C. verumの油脂の主成分は、それぞれシペレン（14.04%）、β-ビサボレン（18.27%）、シナマルデヒド（64.66%）であることが示されました。これらの化学物質は多様な生物活性を示しています。Ahnら[50]は、C. rotundusの根茎から単離された6-アセトキシシペレンが抗腫瘍化合物として作用し、卵巣癌細胞においてカスパーゼ依存性アポトーシスを誘導できることを報告しています。ミルラの精油から抽出されるβ-ビサボレンは、in vitroおよびin vivoの両方でヒトおよびマウスの乳腺腫瘍細胞に対して特異的な細胞毒性を示します[51]。天然抽出物から得られるか、または実験室で合成されたシナマルデヒドには、殺虫、抗菌、抗真菌、抗炎症、免疫調節、抗癌、抗血管新生の活性があると報告されています[52]。
用量依存性成虫活性バイオアッセイの結果は、試験したEOの優れた可能性を示し、ネッタイシマカのMCM-S株とPMD-R株はEOとPBOに対して同様の感受性を示した。 ネッタイシマカ。EOとペルメトリンの有効性を比較したところ、後者の方がより強い殺アレルギー作用を持つことが示された。LD50値は、MCM-S株とPMD-R株の雌でそれぞれ0.44 ng/mgと3.70 ng/mgである。これらの知見は、天然に存在する殺虫剤、特に植物由来製品は、一般に合成物質よりも効果が低いことを示す多くの研究によって裏付けられている[31, 34, 35, 53, 54]。これは、前者が活性成分と不活性成分の複雑な組み合わせであるのに対し、後者は精製された単一の活性化合物であるためと考えられる。しかしながら、作用機序の異なる天然有効成分の多様性と複雑性は、宿主集団における生物活性を高めたり、耐性の発達を阻害したりする可能性がある[55, 56, 57]。多くの研究者が、C. verum、A. galanga、C. rotundus、およびそれらの成分であるβ-ビサボレン、シナマルデヒド、1,8-シネオールの抗蚊作用を報告している[22, 36, 58, 59, 60,61, 62,63,64]。しかし、文献を調査したところ、ペルメトリンまたは他の合成殺虫剤との相乗効果がネッタイシマカ（Aedes aegypti）に対して示されたという報告はこれまでないことが明らかになった。
この研究では、2種類のネッタイシマカ（Aedes aegypti）株の間でペルメトリン感受性に有意な差が観察されました。MCM-Sはペルメトリンに敏感ですが、PMD-Rはそれに対してはるかに低く、耐性率は8.41です。MCM-Sの感受性と比較して、PMD-Rはペルメトリンに対する感受性が低いですが、EOに対する感受性が高いため、EOと組み合わせてペルメトリンの効果を高めることを目的としたさらなる研究の基礎となります。成虫への影響に関する相乗的な組み合わせベースのバイオアッセイでは、EOとペルメトリンの2成分混合物が成虫のネッタイシマカの死亡率を低下または増加させることが示されました。C. verumオイルの追加により、MCM-Sに対するペルメトリンのLD50はわずかに低下しましたが、PMD-Rに対するLD50はわずかに増加し、SR値はそれぞれ1.05と0.96でした。これは、C. verum油がMCM-SおよびPMD-Rに対して試験した場合、ペルメトリンに対して相乗効果も拮抗効果も示さないことを示しています。一方、C. rotundusおよびA. galanga油は、MCM-SまたはPMD-Rに対するペルメトリンのLD50値を有意に低下させることで、顕著な相乗効果を示しました。ペルメトリンをC. rotundusおよびA. galangaのEOと併用した場合、MCM-Sに対するEO-ペルメトリン混合物のSR値はそれぞれ6.28および4.00でした。さらに、ペルメトリンをC. rotundus（SR = 8.81）またはA. galanga（SR = 1233.33）と組み合わせてPMD-Rに対して評価した場合、SR値は有意に増加しました。注目すべきは、C. rotundusとA. galangaの両種が、PMD-Rのネッタイシマカ（Ae. aegypti）に対するペルメトリンの毒性を有意に増強したことです。同様に、PBOもペルメトリンの毒性を増強することが確認され、MCM-S株とPMD-R株に対するSR値はそれぞれ1.69と5.69でした。C. rotundusとA. galangaのSR値が最も高かったため、MCM-S株とPMD-R株に対するペルメトリンの毒性増強において、両種が最も優れた相乗効果を持つと考えられました。
これまでに複数の研究で、合成殺虫剤と植物抽出物の組み合わせが様々な蚊種に対して相乗効果を示すことが報告されている。KalayanasundaramとDas [65] によるハマダラカ（Anopheles Stephensi）に対する幼虫駆除試験では、広域スペクトル有機リン系殺虫剤であるフェンチオンが、Cleodendron inerme（クレオデンドロン・イネルメ）、Pedalium murax（ムラックス）、Parthenium hysterophorus（パルテニウム・ヒステロフォラス）と関連することが示された。抽出物間には有意な相乗効果が認められ、相乗効果（SF）はそれぞれ1.31、1.38、1.40、1.48、1.61、2.23であった。 15種のマングローブ植物の幼虫駆除スクリーニングでは、マングローブの支柱根から抽出した石油エーテル抽出物がCulex quinquefasciatusに対して最も効果的で、LC50値が25.7 mg/Lであることがわかった[66]。この抽出物と植物性殺虫剤ピレスリンとの相乗効果により、C. quinquefasciatusの幼虫に対するピレスリンのLC50が0.132 mg/Lから0.107 mg/Lに低下したことも報告されており、この研究ではSF計算値1.23が使用された。34,35,44]。ハマダラカに対するSolanum citronの根抽出物といくつかの合成殺虫剤（フェンチオン、シペルメトリン（合成ピレスロイド）、チメトホス（有機リン系幼虫駆除剤）など）の併用効果も評価された。 Stephensi [54]およびC. quinquefasciatus [34]に対して、シペルメトリンとイエローフルーツワセリンエーテル抽出物の併用は、すべての比率でシペルメトリンに対する相乗効果を示した。最も効果的な比率は1：1の2元混合物で、An. Stephen West[54]によると、LC50およびSF値はそれぞれ0.0054 ppmと6.83であった。S. xanthocarpumとテメホスの1：1の2元混合物は拮抗的であった（SF = 0.6406）が、S. xanthocarpumとフェンチオンの組み合わせ（1：1）はC. quinquefasciatusに対して相乗効果を示し、SFは1.3125であった[34]。 TongとBlomquist [35]は、植物由来のエチレンオキシドがカルバリル（広域スペクトルのカルバメート）とペルメトリンのネッタイシマカに対する毒性に及ぼす影響について研究した。ネッタイシマカでは、寒天、黒コショウ、ジュニパー、ヘリクリサム、白檀、ゴマ由来のエチレンオキシドがカルバリルのネッタイシマカに対する毒性を高めることが示された。ネッタイシマカの幼虫のSR値は1.0から7.0まで変化する。対照的に、どのEOも成虫のネッタイシマカには毒性がなかった。現段階では、ネッタイシマカとEOカルバリルの組み合わせによる相乗効果は報告されていない。PBOは、ネッタイシマカに対するカルバリルの毒性を高めるための陽性対照として使用された。ネッタイシマカの幼虫と成虫のSR値はそれぞれ4.9～9.5と2.3です。ペルメトリンとEOまたはPBOの2成分混合物のみが幼虫駆除活性について試験されました。EO-ペルメトリン混合物は拮抗効果を示しましたが、PBO-ペルメトリン混合物はネッタイシマカに対して相乗効果を示しました。ネッタイシマカの幼虫。ただし、PBO-ペルメトリン混合物の用量反応実験とSR評価はまだ実施されていません。蚊媒介生物に対する植物合成化合物の組み合わせの相乗効果に関してはほとんど結果が得られていませんが、これらのデータは既存の結果を裏付けており、相乗剤を追加することで適用量を減らすだけでなく、殺虫効果を高める可能性が開かれています。昆虫の効率。さらに、本研究の結果は、ペルメトリンの毒性と併用した場合、C. rotundus および A. galanga のオイルが、ピレスロイド感受性およびピレスロイド抵抗性のネッタイシマカ属（Aedes aegypti）の系統に対して、PBOと比較して相乗的に有意に高い効果を発揮することを初めて実証しました。しかし、相乗効果の解析から予想外の結果が得られ、C. verum オイルが両系統のネッタイシマカに対して最も高い抗成虫活性を示したことが示されました。驚くべきことに、ペルメトリンのネッタイシマカに対する毒性効果は不十分でした。毒性効果と相乗効果の変動は、これらのオイルに含まれる生理活性成分の種類と濃度の違いに一部起因している可能性があります。
効率向上のための取り組みは行われているものの、相乗効果のメカニズムは依然として不明です。有効性と相乗効果が異なる理由としては、試験対象製品の化学組成の違い、および耐性状態と発達に関連する蚊の感受性の違いが考えられます。本研究で試験したエチレンオキシドの主要成分と微量成分には違いがあり、これらの化合物の一部は、様々な害虫や病原体媒介生物に対する忌避効果と毒性効果を持つことが示されています[61,62,64,67,68]。しかし、C. rotundus、A. galanga、C. verumの油に含まれる主要化合物（シペルン、β-ビサボレン、シナマルデヒドなど）については、本研究では、それぞれネッタイシマカ（Aedes aegypti）に対する抗成虫活性および相乗効果について試験されていません。したがって、それぞれの精油に含まれる有効成分を単離し、この蚊媒介生物に対する殺虫効果と相乗相互作用を解明するための今後の研究が必要です。 一般に、殺虫活性は毒物と昆虫組織の作用と反応に依存しており、これは簡略化して3段階に分けることができます。昆虫の体表と標的器官の膜への浸透、活性化（＝標的との相互作用）、および毒素の解毒です[57, 69]。 そのため、毒素の組み合わせの効果を高める殺虫剤の相乗効果には、浸透の増加、蓄積された化合物のより大きな活性化、または農薬有効成分の解毒の低下の少ないなど、これらのカテゴリの少なくとも1つが必要です。 たとえば、エネルギー耐性は肥厚したクチクラを通じたクチクラ浸透を遅らせ、一部の耐性昆虫株で観察される殺虫剤代謝の強化などの生化学的耐性を遅らせます[70, 71]。 EOがペルメトリンの毒性、特にPMD-Rに対する毒性を高める顕著な効果は、耐性機構と相互作用することによって殺虫剤耐性の問題を解決できることを示唆している可能性がある[57, 69, 70, 71]。TongとBlomquist[35]は、EOと合成農薬の相乗作用を実証することにより、この研究結果を裏付けた。ネッタイシマカでは、従来の農薬に対する耐性の発現に密接に関係するシトクロムP450モノオキシゲナーゼやカルボキシルエステラーゼなどの解毒酵素に対する阻害活性の証拠がある。PBOはシトクロムP450モノオキシゲナーゼの代謝阻害剤であると言われているだけでなく、相乗効果研究の陽性対照として使用されることで実証されているように、殺虫剤の浸透を改善するとも言われている[35, 72]。興味深いことに、ガランガル油に含まれる重要な成分の一つである1,8-シネオールは、昆虫種に対する毒性作用で知られており[22, 63, 73]、生物活性研究のいくつかの分野で相乗効果が報告されている[74]。. ,75,76,77]。さらに、1,8-シネオールは、クルクミン[78]、5-フルオロウラシル[79]、メフェナム酸[80]、ジドブジン[81]などの様々な薬剤と併用した場合も、in vitroで浸透促進効果を示すことが報告されている。したがって、1,8-シネオールは、有効成分としてだけでなく、浸透促進剤としても相乗的な殺虫作用を発揮する可能性がある。ペルメトリンとの相乗効果が特にPMD-Rに対して強かったことから、本研究で観察されたガランガル油とトリコサンテス油の相乗効果は、耐性機構との相互作用、すなわち塩素透過性の増加に起因する可能性がある。ピレスロイドは蓄積された化合物の活性化を促進し、シトクロムP450モノオキシゲナーゼやカルボキシルエステラーゼなどの解毒酵素を阻害する。しかしながら、これらの側面については、EOとその単離化合物（単独または併用）が相乗作用機構においてどのような役割を果たしているかを解明するために、さらなる研究が必要である。
1977年に、タイの主要な媒介昆虫群でペルメトリン耐性の増加が報告され、その後数十年間で、ペルメトリンの使用は主に他のピレスロイド系化学物質、特にデルタメトリンに代替された化学物質に置き換えられました[82]。しかし、デルタメトリンや他のクラスの殺虫剤に対する媒介昆虫の耐性は、過剰かつ継続的な使用のために、全国で極めて一般的です[14, 17, 83, 84, 85, 86]。この問題に対処するには、ペルメトリンのように以前は効果的で哺乳類に対する毒性が低い廃棄殺虫剤をローテーションまたは再利用することが推奨されています。現在、ペルメトリンの使用は近年の国の蚊の駆除プログラムで削減されていますが、ペルメトリン耐性は依然として蚊の集団で発見されています。これは、主にペルメトリンや他のピレスロイドからなる市販の家庭用害虫駆除製品に蚊が曝露されているためと考えられます[14, 17]。したがって、ペルメトリンを効果的に再利用するには、ベクター耐性を減らすための戦略の開発と実装が必要です。この研究で個別にテストされた精油はどれもペルメトリンほど効果的ではありませんでしたが、ペルメトリンと併用することで印象的な相乗効果が見られました。これは、EOと耐性メカニズムの相互作用により、ペルメトリンとEOの併用が、特にPMD-R Aedes aegyptiに対して、殺虫剤またはEO単独よりも効果的であるという有望な兆候です。ベクター制御に使用する用量が少ないにもかかわらず、相乗混合物によって効力が高まるという利点は、耐性管理の改善とコストの削減につながる可能性があります[33, 87]。これらの結果から、MCM-S株とPMD-R株の両方において、A. galangaとC. rotundusのEOがペルメトリン毒性の相乗効果においてPBOよりも有意に効果的であり、従来のエルゴジェニックエイドの潜在的な代替品となることは喜ばしいことです。
選定されたEOは、PMD-R Ae. aegyptiに対する成虫毒性を高める上で顕著な相乗効果を示し、特にガランガル油はSR値が最大1233.33であることから、EOはペルメトリンの有効性を高める相乗剤として広く期待されています。これは、新たな活性天然物の使用を促進する可能性があり、これらを組み合わせることで、非常に効果的な蚊駆除製品の使用が増加する可能性があります。また、蚊の個体群における既存の耐性問題に対処するために、旧来の殺虫剤や従来の殺虫剤を効果的に改善する代替相乗剤としてのエチレンオキシドの可能性も示しています。蚊駆除プログラムにおいて入手しやすい植物を使用することは、輸入された高価な資材への依存を減らすだけでなく、公衆衛生システムを強化するための地域的な取り組みを促進することにもつながります。
これらの結果は、エチレンオキシドとペルメトリンの組み合わせによって生じる顕著な相乗効果を明確に示しています。この結果は、蚊の駆除における植物相乗剤としてのエチレンオキシドの可能性を強調し、特に耐性蚊集団に対するペルメトリンの有効性を高めることを示しています。今後の開発と研究では、ガランガル油とアルピニア油、およびそれらの単離化合物の相乗効果に関する生物学的分析、複数の種および段階の蚊に対する天然または合成由来の殺虫剤の組み合わせ、そして非標的生物に対する毒性試験が必要になります。エチレンオキシドは、実用的な代替相乗剤として実用化されます。
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投稿日時: 2024年7月8日