効果的に蚊を駆除する害虫が媒介する病気の発生率を低減するためには、化学農薬に代わる戦略的、持続可能、かつ環境に優しい代替手段が必要です。私たちは、特定のアブラナ科植物の種子粉を、生物学的に不活性なグルコシノレートを酵素加水分解して生成する植物由来イソチオシアネートの供給源として評価し、エジプトネッタイシマカ（L., 1762）の防除に利用しました。 5 種類の脱脂種子粉（Brassica juncea (L) Czern., 1859、Lepidium sativum L., 1753、Sinapis alba L., 1753、Thlaspi arvense L., 1753、Thlaspi arvense – 熱不活性化および酵素分解の 3 つの主なタイプの化学製品。アリルイソチオシアネート、ベンジルイソチオシアネート、4-ヒドロキシベンジルイソチオシアネートの Aedes aegypti の幼虫に対する 24 時間暴露での毒性（LC50）を決定する = 0.04 g/120 ml dH2O）。マスタード、シロカラシ、スギナの LC50 値。種子粉に対するアリルイソチオシアネート（LC50 = 19.35 ppm）および4. -ヒドロキシベンジルイソチオシアネート（LC50 = 55.41 ppm）は、それぞれ0.1 g/120 ml dH2Oと比較して、処理後24時間で幼虫に対してより毒性が強かった。これらの結果は、アルファルファ種子粉の生成と一致している。ベンジルエステルの高い効率は、計算されたLC50値に対応している。種子粉を使用することで、効果的な蚊駆除方法を提供できる。アブラナ科種子粉末とその主な化学成分の蚊の幼虫に対する有効性を示し、アブラナ科種子粉末に含まれる天然化合物が、蚊の駆除のための有望な環境に優しい幼虫駆除剤としてどのように機能するかを示している。
ネッタイシマカ（Aedes属）が媒介する感染症は、依然として世界的に大きな公衆衛生問題となっています。蚊媒介感染症の発生は地理的に広がり1,2,3、再発すると深刻な感染症の流行につながります4,5,6,7。ヒトと動物の間での感染症（チクングニア熱、デング熱、リフトバレー熱、黄熱病、ジカウイルス感染症など）の蔓延は前例のないものです。デング熱だけでも、熱帯地方で約36億人が感染の危険にさらされており、年間推定3億9,000万人が感染し、6,100～24,300人が死亡しています8。南米におけるジカウイルスの再出現と流行は、感染した女性から生まれた子どもに脳障害を引き起こすことから、世界的な注目を集めています2。クレマーら3は、ネッタイシマカの分布範囲は今後も拡大し続け、2050年までに世界人口の半数が蚊媒介性アルボウイルスの感染リスクにさらされるだろうと予測している。
最近開発されたデング熱と黄熱病のワクチンを除き、ほとんどの蚊媒介性疾患に対するワクチンはまだ開発されていません9,10,11。ワクチンは依然として限られた量しか入手できず、臨床試験でのみ使用されています。合成殺虫剤を用いた蚊媒介生物の駆除は、蚊媒介性疾患の蔓延を抑制するための重要な戦略となっています12,13。合成殺虫剤は蚊を殺すのに効果的ですが、合成殺虫剤の継続的な使用は、標的以外の生物に悪影響を及ぼし、環境を汚染します14,15,16。さらに憂慮すべきなのは、化学殺虫剤に対する蚊の耐性が増加傾向にあることです17,18,19。殺虫剤に関連するこれらの問題により、病原体媒介生物を駆除するための効果的で環境に優しい代替手段の探索が加速しています。
害虫駆除のための植物農薬の原料として、様々な植物が開発されてきました20,21。植物由来の物質は生分解性があり、哺乳類、魚類、両生類などの非標的生物に対する毒性が低い、あるいは無視できるほどであるため、一般的に環境に優しいとされています20,22。ハーブ製剤は、様々な作用機序を持つ多様な生理活性化合物を生成し、蚊の様々なライフステージを効果的に駆除することが知られています23,24,25,26。精油やその他の植物由来の有効成分などの植物由来化合物は注目を集めており、蚊媒介生物を駆除するための革新的なツールへの道を開いています。精油、モノテルペン、セスキテルペンは、忌避剤、摂食阻害剤、殺卵剤として作用します27,28,29,30,31,32,33。多くの植物油は蚊の幼虫、蛹、成虫の死を引き起こし34,35,36、昆虫の神経系、呼吸器系、内分泌系、その他の重要な系に影響を及ぼします37。
近年の研究により、カラシナとその種子を生理活性化合物の供給源として利用できる可能性について知見が得られています。カラシナ種子粉は、バイオ燻蒸剤として試験されており38,39,40,41、雑草抑制42,43,44、土壌伝染性植物病原体45,46,47,48,49,50、植物栄養、線虫41,51,52,53,54、害虫55,56,57,58,59,60の土壌改良剤として使用されています。これらの種子粉の殺菌活性は、イソチオシアネートと呼ばれる植物保護化合物によるものとされています38,42,60。植物では、これらの保護化合物は非生理活性グルコシノレートの形で植物細胞内に蓄積されます。しかし、植物が昆虫の摂食や病原菌の感染によって損傷を受けると、グルコシノレートはミロシナーゼによって加水分解され、生理活性イソチオシアネートに変換されます55,61。イソチオシアネートは揮発性化合物であり、広範囲の抗菌・殺虫活性を持つことが知られていますが、その構造、生物学的活性、含有量はアブラナ科植物の種によって大きく異なります42,59,62,63。
マスタード種子粕由来のイソチオシアネートには殺虫活性があることが知られていますが、医学的に重要な節足動物媒介生物に対する生物活性に関するデータは不足しています。私たちの研究では、4種類の脱脂種子粉末のネッタイシマカに対する殺幼虫活性を調べました。ネッタイシマカの幼虫。この研究の目的は、蚊の駆除のための環境に優しい生物農薬としての潜在的使用を評価することです。種子粕の3つの主要化学成分、アリルイソチオシアネート（AITC）、ベンジルイソチオシアネート（BITC）、および4-ヒドロキシベンジルイソチオシアネート（4-HBITC）も検査され、これらの化学成分の蚊の幼虫に対する生物活性が調べられました。これは、4種類のキャベツ種子粉末とその主要化学成分の蚊の幼虫に対する有効性を評価しました。
ネッタイシマカ（ロックフェラー株）の実験室コロニーを、26°C、相対湿度（RH）70%、光周期10:14時間の条件で維持した。交尾した雌はプラスチックケージ（高さ11 cm、直径9.5 cm）に収容し、クエン酸添加牛血液（HemoStat Laboratories Inc.、米国カリフォルニア州ディクソン）を用いた哺乳瓶給餌システムで給餌した。血液供給は、通常通り、膜式マルチガラスフィーダー（Chemglass、Life Sciences LLC、米国ニュージャージー州ヴァインランド）を循環水浴チューブ（HAAKE S7、Thermo-Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）に接続して、37°Cに温度制御して行った。パラフィルムMを各ガラス給餌チャンバー（面積154 mm2）の底に張った。ウシ血液約350～400 μlをパスツールピペット（Fisherbrand、Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いてガラス製フィーダー漏斗に加え、成虫から少なくとも1時間血液を排出させた。次に妊娠した雌に10%ショ糖溶液を与え、個別の超透明スフレカップ（1.25液量オンスサイズ、Dart Container Corp.、米国ミシガン州メイソン）に敷いた湿ったろ紙上に卵を産ませた。 卵の入ったろ紙を密封バッグ（SC Johnsons、ウィスコンシン州ラシーン）に入れ、26°Cで保管した。卵を孵化させ、ウサギ用飼料（ZuPreem、Premium Natural Products、Inc.、米国カンザス州ミッション）とレバーパウダー（MP Biomedicals、LLC、米国オハイオ州ソロン）を混ぜたプラスチックトレイで約200～250匹の幼虫を育てた。魚の切り身（TetraMin、Tetra GMPH、メーア、ドイツ）を2:1:1の割合で混合した。本試験では、3齢後期幼虫を用いた。
本研究で使用した植物種子材料は、以下の商業および政府機関から入手しました。Brassica juncea（ブラウンマスタード-パシフィックゴールド）およびBrassica juncea（ホワイトマスタード-アイダゴールド）は、米国ワシントン州パシフィック・ノースウェスト・ファーマーズ・コーポラティブから入手しました。（ガーデンクレス）は、米国イリノイ州ピオリアのケリー・シード・アンド・ハードウェア社から、Thlaspi arvense（フィールドペニークレス-エリザベス）は米国イリノイ州ピオリアの米国農務省農業研究局から入手しました。本研究で使用した種子は、いずれも農薬処理されていません。本研究で使用したすべての種子材料は、地方および国の規制に従い、関連するすべての地方および州の規制を遵守して加工および使用されました。本研究では、遺伝子組み換え植物品種は調査していません。
Brassica juncea（PG）、アルファルファ（Ls）、シロガラシ（IG）、Thlaspi arvense（DFP）の種子を、0.75 mmメッシュ、ステンレス鋼ローター（歯数12、回転数10,000 rpm）を備えたRetsch ZM200超遠心ミル（Retsch、ドイツ、ハーン）を使用して微粉末に粉砕した（表1）。粉砕した種子粉末を円筒濾紙に移し、ソックスレー装置でヘキサンを用いて24時間脱脂した。脱脂したカラシナのサブサンプルを100 °Cで1時間加熱処理し、ミロシナーゼを変性させ、グルコシノレートが加水分解されて生物活性イソチオシアネートが生成されるのを防いだ。ミロシナーゼを変性させた熱処理スギナ種子粉末（DFP-HT）を陰性対照として使用した。
脱脂種子粉のグルコシノレート含有量を、以前に発表されたプロトコル 64 に従い、高性能液体クロマトグラフィー (HPLC) を用いて3連で測定した。簡単に説明すると、脱脂種子粉末 250 mg サンプルにメタノール 3 mL を加えた。各サンプルをウォーターバスで 30 分間超音波処理し、23°C で 16 時間暗所に置いた。次に、有機層 1 mL を 0.45 μm フィルターでろ過し、オートサンプラーに投入した。島津 HPLC システム (LC 20AD ポンプ 2 台、SIL 20A オートサンプラー、DGU 20As 脱ガッサー、237 nm でモニタリングするための SPD-20A UV-VIS 検出器、CBM-20A 通信バス モジュール) で実行し、種子粉のグルコシノレート含有量を3連で測定した。カラムは C18 Inertsil 逆相カラム (250 mm × 4.6 mm、RP C-18、ODS-3、5u、GL Sciences、米国カリフォルニア州トーランス) でした。初期移動相条件は、12% メタノール/88% 0.01 M テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液 (TBAH、Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス)、流速 1 mL/分に設定されました。15 μl のサンプルを注入した後、初期条件を 20 分間維持し、次に溶媒比を 100% メタノールに調整して、合計サンプル分析時間を 65 分にしました。脱脂種子粉のグルコシノレートの硫黄含有量を推定するため、新たに調製したシナピン、グルコシノレート、およびミロシン標準 (Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス) の段階希釈によって標準曲線 (nM/mAb ベース) を生成しました。サンプル中のグルコシノレート濃度は、Agilent 1100 HPLC（Agilent、カリフォルニア州サンタクララ、米国）で、OpenLAB CDS ChemStationバージョン（C.01.07 SR2 [255]）と同等のカラムを使用し、前述の方法を用いて測定した。グルコシノレート濃度はHPLCシステム間で比較可能である。
アリルイソチオシアネート（94%、安定）およびベンジルイソチオシアネート（98%）は、Fisher Scientific（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）から購入しました。4-ヒドロキシベンジルイソチオシアネートはChemCruz（Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州、米国）から購入しました。ミロシナーゼによる酵素加水分解により、グルコシノレート、グルコシノレート、グルコシノレートはそれぞれアリルイソチオシアネート、ベンジルイソチオシアネート、4-ヒドロキシベンジルイソチオシアネートを生成します。
実験室でのバイオアッセイは、Muturi et al. 32の方法を修正して実施した。本研究では、DFP、DFP-HT、IG、PGおよびLsの5種類の低脂肪種子飼料を使用した。20匹の幼虫を120 mLの脱イオン水（dH2O）を入れた400 mL使い捨て三方ビーカー（VWR International, LLC、米国ペンシルベニア州ラドナー）に入れた。蚊の幼虫に対する毒性について、DFP種子粉、DFP-HT、IGおよびPGについて、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1および0.12 g種子粉/120 ml dH2Oの7種類の種子粉濃度で試験した。予備的なバイオアッセイでは、脱脂Ls種子粉は試験した他の4種類の種子粉よりも毒性が強いことが示されている。したがって、Ls 種子粉の 7 つの処理濃度を次の濃度に調整しました: 0.015、0.025、0.035、0.045、0.055、0.065、および 0.075 g/120 mL dH2O。
試験条件下での正常な昆虫死亡率を評価するため、未処理の対照群（dH20、種子ミール添加なし）を含めた。各種子ミールの毒性生物学的検定には、3 つの反復 3 傾斜ビーカー（ビーカーあたり後期第 3 齢幼虫 20 匹）で合計 108 本のバイアルを使用した。処理済み容器は室温（20～21°C）で保管し、処理濃度への 24 時間および 72 時間の連続曝露中の幼虫死亡率を記録した。蚊の体および付属肢を薄いステンレス製のスパチュラで刺したり触れたりしても動かない場合、その蚊の幼虫は死亡したと判断する。死亡した幼虫は通常、容器の底または水面で背側または腹側に静止している。実験は異なる幼虫グループを使用して異なる日に 3 回繰り返され、合計 180 匹の幼虫が各処理濃度に曝露された。
AITC、BITC、および4-HBITCの蚊の幼虫に対する毒性は、同じ生物学的検定手順を用いて異なる処理で評価されました。2 mL遠心管に各化学物質100 µLを無水エタノール900 µLに加え、30秒間振盪して十分に混合することで、各化学物質の100,000 ppmストック溶液を調製しました。処理濃度は、BITCがAITCおよび4-HBITCよりもはるかに毒性が強いことが判明した予備的な生物学的検定に基づいて決定されました。毒性を決定するために、BITCの5つの濃度（1、3、6、9、および12 ppm）、AITCの7つの濃度（5、10、15、20、25、30、および35 ppm）、および4-HBITCの6つの濃度（15、15、20、25、30、および35 ppm）を使用しました。対照区には、化学処理の最大量に相当する108μLの無水エタノールを注入した。生物検定は上記と同様に繰り返し、処理濃度ごとに合計180匹の幼虫を曝露した。24時間連続曝露後のAITC、BITC、4-HBITCの各濃度における幼虫死亡率を記録した。
Polo ソフトウェア (Polo Plus、LeOra Software、バージョン 1.0) を使用して、65 件の用量関連死亡データのプロビット分析を実行し、50% 致死濃度 (LC50)、90% 致死濃度 (LC90)、傾き、致死量係数、および 95 % 致死濃度を計算しました。これは、対数変換された濃度と用量死亡率曲線の致死量比の信頼区間に基づいています。死亡率データは、各処理濃度にさらされた 180 匹の幼虫の複合反復データに基づいています。確率分析は、各種子粉と各化学成分に対して個別に実行されました。致死量比の 95% 信頼区間に基づき、蚊の幼虫に対する種子粉と化学成分の毒性は有意に異なると判断されたため、値 1 を含む信頼区間では有意差はありませんでした (P = 0.0566)。
脱脂種子粉（DFP、IG、PG、Ls）に含まれる主要グルコシノレートのHPLC分析結果を表1に示す。試験した種子粉に含まれる主要グルコシノレートは、ミロシナーゼ由来グルコシノレートを含むDFPとPGを除いてそれぞれ異なっていた。PG中のミロシニン含有量はDFPよりも高く、それぞれ33.3 ± 1.5 mg/gと26.5 ± 0.9 mg/gであった。Ls種子粉にはグルコグリコンが36.6 ± 1.2 mg/g含まれていたのに対し、IG種子粉にはシナピンが38.0 ± 0.5 mg/g含まれていた。
脱脂種子粉で処理するとネッタイシマカ（Aedes aegypti）の幼虫が死滅しましたが、処理の効果は植物種によって異なりました。DFP-NTのみが、24時間および72時間の暴露後、蚊の幼虫に対して毒性を示さなかった（表2）。活性種子粉末の毒性は、濃度の増加とともに増加しました（図1A、B）。蚊の幼虫に対する種子粉の毒性は、24時間および72時間の評価におけるLC50値の致死量比の95％CIに基づいて大幅に異なりました（表3）。24時間後、Ls種子粉の毒性効果は他の種子粉処理よりも大きく、幼虫に対する活性と毒性が最も高かった（LC50 = 0.04 g/120 ml dH2O）。幼虫は、IG、Ls、PG種子粉末処理と比較して、24時間でDFPに対する感受性が低く、LC50値はそれぞれ0.115、0.04、0.08 g/120 ml dH2Oであり、LC50値0.211 g/120 ml dH2Oよりも統計的に高かった（表3）。DFP、IG、PG、LsのLC90値は、それぞれ0.376、0.275、0.137、0.074 g/120 ml dH2Oであった（表2）。DPPの最高濃度は0.12 g/120 ml dH2Oであった。24時間の評価後、平均幼虫死亡率はわずか12％であったが、IGおよびPG幼虫の平均死亡率はそれぞれ51％と82％に達した。 24 時間の評価後、最高濃度の Ls 種子粉処理 (0.075 g/120 ml dH2O) での平均幼虫死亡率は 99% でした (図 1A)。
死亡率曲線は、処理後24時間（A）および72時間（B）の種子粕濃度に対するAe.エジプト幼虫（3齢幼虫）の用量反応（Probit）から推定された。点線は種子粕処理のLC50を示す。DFP Thlaspi arvense、DFP-HT 加熱不活化 Thlaspi arvense、IG Sinapsis alba（Ida Gold）、PG Brassica juncea（Pacific Gold）、Ls Lepidium sativum。
72時間後の評価において、DFP、IG、PG種子粕のLC50値はそれぞれ0.111、0.085、0.051 g/120 ml dH2Oであった。Ls種子粕に曝露された幼虫は72時間後にほぼ全て死亡したため、死亡率データはプロビット分析と一致しなかった。他の種子粕と比較して、幼虫はDFP種子粕処理に対する感受性が低く、統計的に高いLC50値を示した（表2および表3）。72時間後、DFP、IG、PG種子粕処理のLC50値はそれぞれ0.111、0.085、0.05 g/120 ml dH2Oと推定された。 72時間後の評価において、DFP、IG、PG種子粉のLC90値はそれぞれ0.215、0.254、0.138 g/120 ml dH2Oでした。72時間後の評価において、最大濃度0.12 g/120 ml dH2OにおけるDFP、IG、PG種子粉処理における平均幼虫死亡率はそれぞれ58%、66%、96%でした（図1B）。72時間後の評価において、PG種子粉はIGおよびDFP種子粉よりも毒性が強いことが分かりました。
合成イソチオシアネートであるアリルイソチオシアネート（AITC）、ベンジルイソチオシアネート（BITC）、および4-ヒドロキシベンジルイソチオシアネート（4-HBITC）は、蚊の幼虫を効果的に殺すことができます。処理後24時間で、BITCは幼虫に対する毒性が強く、LC50値は5.29ppmでした。一方、AITCは19.35ppm、4-HBITCは55.41ppmでした（表4）。AITCおよびBITCと比較して、4-HBITCは毒性が低く、LC50値は高いです。最も強力なシードミールに含まれる2つの主要なイソチオシアネート（LsおよびPG）の蚊の幼虫に対する毒性には、有意な差があります。 AITC、BITC、4-HBITC間のLC50値の致死量比に基づく毒性は、LC50致死量比の95%信頼区間に1が含まれないという統計的有意差を示した（P = 0.05、表4）。BITCとAITCの最高濃度は、試験した幼虫の100%を殺すと推定された（図2）。
死亡率曲線は、Aeの用量反応（Probit）から推定されました。処理24時間後、エジプト幼虫（3齢幼虫）は合成イソチオシアネート濃度に達しました。点線はイソチオシアネート処理のLC50を示しています。ベンジルイソチオシアネート（BITC）、アリルイソチオシアネート（AITC）、および4-HBITC。
植物由来のバイオ農薬を蚊媒介生物防除剤として利用する研究は長年行われてきました。多くの植物は殺虫活性を持つ天然化学物質を生産します37。これらの生物活性化合物は、蚊を含む害虫の防除に大きな可能性を秘めた、合成殺虫剤に代わる魅力的な選択肢となります。
マスタード植物は、種子を採取するための作物として栽培され、スパイスや油の原料として利用されます。種子からマスタードオイルを抽出したり、マスタードをバイオ燃料として抽出したりすると、副産物として脱脂された種子粕が生成されます。この種子粕には、天然の生化学成分や加水分解酵素の多くが含まれています。この種子粕の毒性は、イソチオシアネートの生成に起因します55,60,61。イソチオシアネートは、種子粕の加水過程において、ミロシナーゼという酵素によってグルコシノレートが加水分解されて生成され38,55,70、殺菌作用、殺菌線虫作用、殺虫作用に加え、化学感覚作用や化学療法作用などの特性を持つことが知られています61,62,70。いくつかの研究では、マスタード植物と種子粕が土壌害虫や貯蔵食品害虫に対する燻蒸剤として効果的に作用することが示されています57,59,71,72。本研究では、4種の種子粉とその3種の生理活性物質であるAITC、BITC、および4-HBITCのネッタイシマカの幼虫に対する毒性を評価しました。ネッタイシマカ。蚊の幼虫を含む水に種子粉を直接添加すると、蚊の幼虫に有毒なイソチオシアネートを生成する酵素プロセスが活性化されると予想されます。この生体内変化は、種子粉の幼虫駆除活性の観察と、使用前にドワーフマスタード種子粉を熱処理した場合の殺虫活性の消失によって部分的に実証されました。熱処理によりグルコシノレートを活性化する加水分解酵素が破壊され、生理活性イソチオシアネートの形成が防止されると予想されます。これは、水生環境における蚊に対するキャベツ種子粉末の殺虫特性を確認した初の研究です。
試験した種子粉末の中で、クレソン種子粉末（Ls）が最も毒性が強く、ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）に高い死亡率を示した。ネッタイシマカ（Aedes aegypti）の幼虫は24時間連続処理された。残りの3種類の種子粉末（PG、IG、DFP）は活性が低かったが、72時間連続処理後も有意な死亡率を示した。Ls種子粉末のみが有意な量のグルコシノレートを含んでいたのに対し、PGとDFPはミロシナーゼを、IGはグルコシノレートを主要なグルコシノレートとして含んでいた（表1）。グルコトロパオリンはBITCに加水分解され、シナルビンは4-HBITCに加水分解される61,62。我々の生物検定結果は、Ls種子粉末と合成BITCの両方が蚊の幼虫に対して高い毒性を持つことを示した。 PGおよびDFP種子粉の主成分はミロシナーゼグルコシノレートで、加水分解されてAITCになります。AITCは蚊の幼虫を殺虫する効果があり、LC50値は19.35ppmです。AITCおよびBITCと比較して、4-HBITCイソチオシアネートは幼虫に対する毒性が最も低いです。AITCはBITCよりも毒性が低いものの、そのLC50値は蚊の幼虫に対して試験された多くの精油よりも低いです32,73,74,75。
蚊の幼虫駆除に使用する当社のアブラナ科植物種子粉末には、主要なグルコシノレートが1種類含まれており、HPLC分析で総グルコシノレートの98～99%以上を占めています。その他のグルコシノレートも微量に検出されましたが、総グルコシノレートの0.3%未満でした。クレソン（L. sativum）種子粉末には、二次グルコシノレート（シニグリン）が含まれていますが、その割合は総グルコシノレートの1%に過ぎず、含有量も微量です（約0.4 mg/g種子粉末）。PGとDFPは、同じ主要なグルコシノレート（ミロシン）を含みますが、LC50値の違いにより、それぞれの種子粉末の幼虫駆除活性は大きく異なります。うどんこ病に対する毒性はそれぞれ異なります。ネッタイシマカ（Aedes aegypti）の幼虫の発生は、2種類の種子飼料におけるミロシナーゼ活性または安定性の違いに起因する可能性があります。ミロシナーゼ活性は、アブラナ科植物におけるイソチオシアネートなどの加水分解産物のバイオアベイラビリティに重要な役割を果たしています76。Pocockら77およびWilkinsonら78による過去の報告では、ミロシナーゼ活性および安定性の変化は遺伝的要因および環境的要因とも関連している可能性があることが示されています。
対応する化学物質の適用と比較するため、各種子粉の24時間および72時間でのLC50値に基づいて、予想される生物活性イソチオシアネート含有量を計算しました（表5）。24時間後、種子粉中のイソチオシアネートは、純粋な化合物よりも毒性が強くなりました。イソチオシアネート種子処理のppmに基づいて計算されたLC50値は、BITC、AITC、および4-HBITC適用のLC50値よりも低かったです。幼虫が種子粉ペレットを食べているのを観察しました（図3A）。その結果、幼虫は種子粉ペレットを摂取することで、毒性イソチオシアネートにさらに集中して曝露される可能性があります。これは、24時間曝露でのIGおよびPG種子粉処理で最も顕著で、LC50濃度は、純粋なAITCおよび4-HBITC処理よりもそれぞれ75％および72％低かったです。 LsおよびDFP処理は、純粋なイソチオシアネートよりも毒性が強く、LC50値はそれぞれ24%および41%低かった。対照区の幼虫は蛹化に成功した（図3B）のに対し、種子粉処理区の幼虫のほとんどは蛹化せず、幼虫の発育は著しく遅延した（図3B、D）。Spodopteralitura属において、イソチオシアネートは成長遅延および発育遅延と関連付けられている79。
ネッタイシマカ（Aedes aegypti）の幼虫を、アブラナ科植物の種子粉末に24～72時間連続曝露した。（A）口器に種子粉末の粒子（丸で囲んだ部分）が付着した死んだ幼虫。（B）対照処理（種子粉末を添加しない純水）では、幼虫は正常に成長し、72時間後に蛹化を開始する。（C、D）種子粉末を投与した幼虫。種子粉末は発育に差が見られ、蛹化はしなかった。
イソチオシアネートが蚊の幼虫に及ぼす毒性作用のメカニズムについては、未だ研究が進んでいません。しかしながら、アカヒアリ（Solenopsis invicta）を用いた過去の研究では、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）およびエステラーゼ（EST）の阻害がイソチオシアネートの生物活性の主たるメカニズムであり、AITCは低濃度であってもGST活性を阻害できることが示されています。低濃度のアカヒアリでは、AITCは0.5 µg/mlの用量でGST活性を阻害します80。一方、AITCはトウモロコシゾウムシ（Sitophilus zeamais）成虫のアセチルコリンエステラーゼを阻害します81。蚊の幼虫におけるイソチオシアネートの活性メカニズムを解明するためにも、同様の研究を行う必要があります。
我々は、加熱不活化 DFP 処理を用いて、植物グルコシノレートが加水分解されて反応性イソチオシアネートが形成されることが、マスタード種子粕による蚊の幼虫駆除のメカニズムとして機能しているという説を支持する。DFP-HT 種子粕は、試験した施用量では毒性がなかった。Lafarga ら 82 は、グルコシノレートが高温で分解されやすいことを報告した。また、加熱処理により、種子粕中のミロシナーゼ酵素が変性し、グルコシノレートが加水分解されて反応性イソチオシアネートが形成されるのを防ぐことが期待される。これは、Okunade ら 75 によっても確認され、ミロシナーゼは温度に敏感であり、マスタード、クロガラシ、および赤根茎の種子を 80°C を超える温度にさらすとミロシナーゼの活性が完全に不活化されることが示されている。これらのメカニズムにより、加熱処理した DFP 種子粕の殺虫活性が失われる可能性がある。
このように、マスタードシードミールとその主要3種のイソチオシアネートは蚊の幼虫に対して毒性があります。シードミールと化学処理のこれらの違いを考慮すると、シードミールの使用は蚊の駆除に効果的な方法となる可能性があります。シードミールの使用における有効性と安定性を向上させるには、適切な製剤と効果的な送達システムを特定する必要があります。私たちの研究結果は、マスタードシードミールが合成殺虫剤の代替として使用できる可能性を示しています。この技術は、蚊媒介生物を駆除するための革新的なツールとなる可能性があります。蚊の幼虫は水環境で繁殖し、シードミールに含まれるグルコシノレートは水和すると酵素によって活性イソチオシアネートに変換されるため、蚊が生息する水域でマスタードシードミールを使用することで、大きな駆除効果が期待できます。イソチオシアネートの幼虫駆除活性は様々ですが（BITC > AITC > 4-HBITC）、種子粕と複数のグルコシノレートを併用することで相乗的に毒性が増強されるかどうかについては、さらなる研究が必要です。本研究は、脱脂アブラナ科植物種子粕と3種類の生理活性イソチオシアネートの蚊に対する殺虫効果を実証した初の研究です。本研究の結果は、キャベツ種子から油脂を抽出する際に副産物として得られる脱脂キャベツ種子粕が、蚊の駆除における有望な幼虫駆除剤として作用する可能性を示した点で、新たな知見を開拓するものです。この情報は、植物由来の生物防除剤の発見と、安価で実用的かつ環境に優しい生物農薬としての開発を促進する上で役立つと考えられます。
本研究のために生成されたデータセットとその解析結果は、責任著者に合理的な請求があれば入手可能です。研究終了時に、研究に使用したすべての材料（昆虫および種子粉）は破棄されました。
投稿日時: 2024年7月29日