効果的に蚊を駆除する害虫が媒介する病気の発生率を減らすためには、化学農薬に代わる戦略的で持続可能かつ環境に優しい代替手段が必要です。私たちは、エジプトネッタイシマカ（L., 1762）の防除に使用するために、特定のアブラナ科植物（Brassica属）の種子粉末を、生物学的に不活性なグルコシノレートの酵素加水分解によって生成される植物由来のイソチオシアネートの供給源として評価しました。 5種類の脱脂種子ミール（Brassica juncea (L) Czern., 1859、Lepidium sativum L., 1753、Sinapis alba L., 1753、Thlaspi arvense L., 1753、Thlaspi arvense – 3つの主要なタイプの熱不活性化と酵素分解化学製品アリルイソチオシアネート、ベンジルイソチオシアネート、および4-ヒドロキシベンジルイソチオシアネートのネッタイシマカ幼虫に対する24時間曝露時の毒性（LC50）を決定するため = 0.04 g/120 ml dH2O）。カラシナ、白カラシナ、およびスギナのLC50値。種子ミールは、アリルイソチオシアネート（LC50 = 19.35 ppm）および 4-ヒドロキシベンジルイソチオシアネート（LC50 = 55.41 ppm）と比較して、それぞれ 0.05、0.08、0.05 であり、処理後 24 時間で、それぞれ 0.1 g/120 ml dH2O よりも幼虫に対して毒性が高かった。これらの結果は、アルファルファ種子ミールの製造と一致している。ベンジルエステルの効率の高さは、計算された LC50 値に対応する。種子ミールを使用することで、蚊の駆除に効果的な方法を提供できる。アブラナ科種子粉末とその主な化学成分の蚊の幼虫に対する有効性を示し、アブラナ科種子粉末中の天然化合物が蚊の駆除に有望な環境に優しい殺幼虫剤としてどのように役立つかを示している。
ネッタイシマカによる媒介性疾患は、依然として世界的な公衆衛生上の大きな問題である。蚊媒介性疾患の発生は地理的に広がり1,2,3、再出現して重篤な疾患の流行につながる4,5,6,7。人間と動物の間での疾患の蔓延（チクングニア熱、デング熱、リフトバレー熱、黄熱病、ジカウイルスなど）は前例のないものである。デング熱だけでも、熱帯地域で約36億人が感染リスクにさらされており、年間推定3億9000万人が感染し、年間6,100人から24,300人が死亡している8。南米でのジカウイルスの再出現と流行は、感染した女性から生まれた子供に脳障害を引き起こすため、世界的な注目を集めている2。 Kremerらは、ネッタイシマカの生息域は拡大し続け、2050年までに世界人口の半分が蚊媒介性アルボウイルス感染のリスクにさらされると予測している。
デング熱と黄熱病に対する最近開発されたワクチンを除いて、ほとんどの蚊媒介性疾患に対するワクチンはまだ開発されていません9,10,11。ワクチンはまだ限られた量しか入手できず、臨床試験でのみ使用されています。合成殺虫剤を使用した蚊媒介生物の制御は、蚊媒介性疾患の蔓延を制御するための重要な戦略でした12,13。合成殺虫剤は蚊を殺すのに効果的ですが、合成殺虫剤の継続的な使用は非標的生物に悪影響を与え、環境を汚染します14,15,16。さらに憂慮すべきは、化学殺虫剤に対する蚊の耐性が増加する傾向です17,18,19。殺虫剤に関連するこれらの問題により、病原体媒介生物を制御するための効果的で環境に優しい代替手段の探索が加速しています。
害虫駆除のための植物農薬の供給源として、さまざまな植物が開発されてきました20,21。植物物質は一般的に生分解性があり、哺乳類、魚類、両生類などの非標的生物に対する毒性が低いか無視できる程度であるため、環境に優しいです20,22。ハーブ製剤は、蚊のさまざまなライフステージを効果的に制御するために、さまざまな作用機序を持つさまざまな生物活性化合物を生成することが知られています23,24,25,26。精油やその他の植物活性成分などの植物由来化合物は注目を集め、蚊媒介生物を制御するための革新的なツールへの道を開きました。精油、モノテルペン、セスキテルペンは、忌避剤、摂食阻害剤、殺卵剤として作用します27,28,29,30,31,32,33。多くの植物油は蚊の幼虫、蛹、成虫の死を引き起こし、昆虫の神経系、呼吸器系、内分泌系、その他の重要なシステムに影響を与えます34,35,36,37。
最近の研究では、カラシナとその種子を生物活性化合物の供給源として利用できる可能性が示唆されている。カラシナ種子粉末は、生物燻蒸剤として試験され38,39,40,41、雑草抑制42,43,44、土壌伝染性植物病原菌45,46,47,48,49,50の防除、植物栄養、線虫41,51,52,53,54、害虫55,56,57,58,59,60の防除のための土壌改良剤として使用されている。これらの種子粉末の殺菌活性は、イソチオシアネートと呼ばれる植物保護化合物に起因する38,42,60。植物では、これらの保護化合物は、非生物活性グルコシノレートの形で植物細胞に蓄積される。しかし、植物が昆虫の摂食や病原菌の感染によって損傷を受けると、グルコシノレートはミロシナーゼによって加水分解されて生物活性イソチオシアネートになる55,61。イソチオシアネートは広範囲の抗菌作用と殺虫作用を持つことが知られている揮発性化合物であり、その構造、生物活性、含有量はアブラナ科の種によって大きく異なる42,59,62,63。
マスタードシードミール由来のイソチオシアネートには殺虫活性があることが知られているが、医学的に重要な節足動物ベクターに対する生物活性に関するデータは不足している。本研究では、4種類の脱脂種子粉末のネッタイシマカに対する殺幼虫活性を調べた。ネッタイシマカの幼虫。本研究の目的は、蚊の防除のための環境に優しい生物農薬としてのそれらの潜在的な使用を評価することであった。種子ミールの3つの主要な化学成分、アリルイソチオシアネート（AITC）、ベンジルイソチオシアネート（BITC）、および4-ヒドロキシベンジルイソチオシアネート（4-HBITC）も試験し、これらの化学成分の蚊の幼虫に対する生物活性を試験した。これは、4種類のキャベツ種子粉末とその主要な化学成分の蚊の幼虫に対する有効性を評価した最初の報告である。
実験室で飼育したネッタイシマカ（ロックフェラー系統）は、26℃、相対湿度70%、明暗周期10:14時間で維持した。交尾した雌はプラスチック製のケージ（高さ11cm、直径9.5cm）に入れ、クエン酸処理したウシ血液（HemoStat Laboratories Inc.、Dixon、CA、USA）を用いた給餌ボトルシステムで給餌した。給餌は、温度制御37℃の循環式水浴槽（HAAKE S7、Thermo-Scientific、Waltham、MA、USA）に接続された膜式マルチガラス給餌器（Chemglass、Life Sciences LLC、Vineland、NJ、USA）を用いて通常通り行った。各ガラス給餌チャンバーの底にパラフィルムMのフィルム（面積154mm2）を張る。次に、各給餌器を交尾中の雌が入ったケージを覆う上部グリッドの上に置いた。約 350～400 μl のウシ血液をパスツールピペット (Fisherbrand、Fisher Scientific、Waltham、MA、USA) を使用してガラスフィーダー漏斗に加え、成虫を少なくとも 1 時間排出させた。次に妊娠した雌に 10% ショ糖溶液を与え、個々の超透明スフレカップ (1.25 fl oz サイズ、Dart Container Corp.、Mason、MI、USA) に敷いた湿ったろ紙に産卵させた。ケージに水を入れた。卵の付いたろ紙を密封袋 (SC Johnsons、Racine、WI) に入れ、26°C で保管した。卵を孵化させ、約 200～250 匹の幼虫をウサギの飼料 (ZuPreem、Premium Natural Products、Inc.、Mission、KS、USA) と肝臓粉末 (MP Biomedicals、LLC、Solon、OH、USA) の混合物が入ったプラスチックトレイで飼育した。魚の切り身（TetraMin、Tetra GMPH、ドイツ、メーア）を2：1：1の比率で混合した。生物検定には、3齢後期の幼虫を使用した。
本研究で使用した植物種子は、以下の商業および政府機関から入手しました。米国ワシントン州のパシフィック・ノースウェスト・ファーマーズ協同組合からBrassica juncea（ブラウンマスタード-パシフィックゴールド）とBrassica juncea（ホワイトマスタード-アイダゴールド）、米国イリノイ州ピオリアのケリーシードアンドハードウェア社から（ガーデンクレス）、米国イリノイ州ピオリアのUSDA-ARSからThlaspi arvense（フィールドペニークレス-エリザベス）を入手しました。本研究で使用した種子はいずれも農薬処理されていません。すべての種子は、地域および国の規制に従って処理され、本研究で使用されました。また、関連するすべての地方、州、国の規制にも準拠しています。本研究では、遺伝子組み換え植物品種は調査していません。
Brassica juncea (PG)、アルファルファ (Ls)、ホワイトマスタード (IG)、Thlaspi arvense (DFP) の種子を、0.75 mm メッシュとステンレス鋼ローター、12 歯、10,000 rpm を備えた Retsch ZM200 超遠心ミル (Retsch、Haan、ドイツ) を使用して微粉末に粉砕した (表 1)。粉砕した種子粉末を紙製シンブルに移し、ソックスレー抽出器でヘキサンを使用して 24 時間脱脂した。脱脂したフィールドマスタードのサブサンプルを 100 °C で 1 時間加熱処理してミロシナーゼを変性させ、グルコシノレートの加水分解による生物活性イソチオシアネートの生成を防いだ。加熱処理したスギナ種子粉末 (DFP-HT) をミロシナーゼを変性させることでネガティブコントロールとして使用した。
脱脂種子ミールのグルコシノレート含有量は、以前に発表されたプロトコル64に従って、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用して3回測定した。簡単に説明すると、250 mgの脱脂種子粉末サンプルに3 mLのメタノールを加えた。各サンプルを水浴で30分間超音波処理し、23℃で16時間暗所に置いた。有機層の1 mLアリコートを0.45 μmフィルターでろ過し、オートサンプラーに入れた。島津製作所のHPLCシステム（2台のLC 20ADポンプ、SIL 20Aオートサンプラー、DGU 20As脱気装置、237 nmでモニタリングするためのSPD-20A UV-VIS検出器、およびCBM-20A通信バスモジュール）で、島津製作所のLC Solutionソフトウェアバージョン1.25（島津製作所、米国メリーランド州コロンビア）を使用して、種子ミールのグルコシノレート含有量を3回測定した。カラムは C18 Inertsil 逆相カラム (250 mm × 4.6 mm; RP C-18、ODS-3、5u; GL Sciences、トーランス、カリフォルニア州、米国) でした。初期移動相条件は、12% メタノール/88% 0.01 M テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液 (TBAH; Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) に設定し、流速は 1 mL/min としました。15 μl のサンプルを注入した後、初期条件を 20 分間維持し、その後、溶媒比を 100% メタノールに調整し、合計サンプル分析時間は 65 分でした。脱脂種子ミールの硫黄含有量を推定するために、新たに調製したシナピン、グルコシノレート、ミロシン標準品 (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) の連続希釈により標準曲線 (nM/mAb ベース) を作成しました。サンプル中のグルコシノレート濃度は、同じカラムを備え、以前に説明した方法を使用して、OpenLAB CDS ChemStation バージョン (C.01.07 SR2 [255]) を搭載した Agilent 1100 HPLC (Agilent、Santa Clara、CA、USA) でテストされました。グルコシノレート濃度が決定され、HPLC システム間で比較可能になりました。
アリルイソチオシアネート（94%、安定）とベンジルイソチオシアネート（98%）はFisher Scientific（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）から購入した。4-ヒドロキシベンジルイソチオシアネートはChemCruz（Santa Cruz Biotechnology、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）から購入した。グルコシノレート、グルコシノレート、グルコシノレートは、ミロシナーゼによって酵素的に加水分解されると、それぞれアリルイソチオシアネート、ベンジルイソチオシアネート、4-ヒドロキシベンジルイソチオシアネートを生成する。
実験室でのバイオアッセイは、Muturi ら 32 の方法に修正を加えて実施した。この研究では、DFP、DFP-HT、IG、PG、Ls の 5 種類の低脂肪種子飼料を使用した。20 匹の幼虫を、120 mL の脱イオン水 (dH2O) が入った 400 mL の使い捨て三方ビーカー (VWR International, LLC、Radnor、PA、USA) に入れた。蚊の幼虫の毒性について、7 種類の種子粉末濃度を試験した。DFP 種子粉末、DFP-HT、IG、PG については、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12 g 種子粉末/120 ml dH2O である。予備的なバイオアッセイでは、脱脂 Ls 種子粉末が、試験した他の 4 種類の種子粉末よりも毒性が高いことが示された。そこで、Ls種子粉末の7つの処理濃度を、0.015、0.025、0.035、0.045、0.055、0.065、および0.075 g/120 mL dH2Oの濃度に調整しました。
試験条件下での通常の昆虫死亡率を評価するために、未処理の対照群（dH2O、種子ミール添加なし）を含めた。各種子ミールの毒性バイオアッセイには、3つの反復3傾斜ビーカー（ビーカーあたり20匹の後期3齢幼虫）が含まれ、合計108本のバイアルを使用した。処理済み容器は室温（20～21℃）で保管し、処理濃度への24時間および72時間の連続曝露中に幼虫の死亡率を記録した。蚊の体と付属肢が薄いステンレス製のヘラで刺したり触れたりしても動かない場合、蚊の幼虫は死亡しているとみなされる。死亡した幼虫は通常、容器の底または水面に背側または腹側の姿勢で動かない。この実験は、異なる幼虫群を使用して異なる日に3回繰り返され、各処理濃度に曝露された幼虫は合計180匹であった。
AITC、BITC、および4-HBITCの蚊の幼虫に対する毒性は、同じバイオアッセイ手順を使用して評価したが、処理方法は異なっていた。各化学物質の100,000 ppmストック溶液を、2 mL遠心分離管内の900 µLの無水エタノールに100 µLの化学物質を加え、30秒間振とうして十分に混合することにより調製した。処理濃度は、BITCがAITCおよび4-HBITCよりもはるかに毒性が高いことがわかった予備バイオアッセイに基づいて決定した。毒性を決定するために、BITCの5つの濃度（1、3、6、9、および12 ppm）、AITCの7つの濃度（5、10、15、20、25、30、および35 ppm）、および4-HBITCの6つの濃度（15、15、20、25、30、および35 ppm）を使用した。 30、45、60、75、90 ppm）。対照処理には、化学処理の最大容量に相当する108 μLの無水エタノールを注入した。バイオアッセイは上記と同様に繰り返し、各処理濃度につき合計180匹の幼虫を曝露した。幼虫の死亡率は、AITC、BITC、および4-HBITCの各濃度について、24時間の連続曝露後に記録した。
65 の用量関連死亡率データのプロビット分析を Polo ソフトウェア (Polo Plus、LeOra Software、バージョン 1.0) を使用して実行し、50% 致死濃度 (LC50)、90% 致死濃度 (LC90)、傾き、致死量係数、および 95% 致死濃度を計算した。対数変換された濃度と用量-死亡率曲線の致死量比の信頼区間に基づく。死亡率データは、各処理濃度に曝露された 180 匹の幼虫の複合反復データに基づいている。確率分析は、各シードミールと各化学成分について別々に実行された。致死量比の 95% 信頼区間に基づいて、シードミールと化学成分の蚊の幼虫に対する毒性は有意に異なると考えられたため、信頼区間に 1 の値が含まれる場合は有意差がないと判断された (P = 0.0566)。
脱脂種子粉DFP、IG、PG、Lsの主要グルコシノレートの定量に関するHPLCの結果を表1に示す。試験した種子粉の主要グルコシノレートは、ミロシナーゼグルコシノレートを含むDFPとPGを除いて異なっていた。PGのミロシニン含有量はDFPよりも高く、それぞれ33.3 ± 1.5 mg/gと26.5 ± 0.9 mg/gであった。Ls種子粉末には36.6 ± 1.2 mg/gのグルコグリコンが含まれていたのに対し、IG種子粉末には38.0 ± 0.5 mg/gのシナピンが含まれていた。
脱脂種子粉末で処理すると、ネッタイシマカの幼虫は死滅したが、処理の効果は植物種によって異なった。24 時間および 72 時間曝露後、蚊の幼虫に対して毒性を示さなかったのは DFP-NT のみであった (表 2)。活性種子粉末の毒性は濃度の上昇とともに増加した (図 1A、B)。種子粉末の蚊の幼虫に対する毒性は、24 時間および 72 時間評価における LC50 値の致死量比の 95% CI に基づいて大きく異なった (表 3)。24 時間後、Ls 種子粉末の毒性効果は他の種子粉末処理よりも大きく、最も高い活性と幼虫に対する最大の毒性を示した (LC50 = 0.04 g/120 ml dH2O)。幼虫は、24 時間後には IG、Ls、PG 種子粉末処理と比較して DFP に対する感受性が低く、LC50 値はそれぞれ 0.115、0.04、0.08 g/120 ml dH2O であり、LC50 値 0.211 g/120 ml dH2O より統計的に高かった (表 3)。DFP、IG、PG、Ls の LC90 値はそれぞれ 0.376、0.275、0.137、0.074 g/120 ml dH2O であった (表 2)。DPP の最高濃度は 0.12 g/120 ml dH2O であった。24 時間の評価後、幼虫の平均死亡率はわずか 12% であったが、IG および PG 幼虫の平均死亡率はそれぞれ 51% および 82% に達した。 24時間の評価後、Ls種子粉末処理の最高濃度（0.075 g/120 ml dH2O）における幼虫の平均死亡率は99%であった（図1A）。
死亡率曲線は、処理後24時間（A）および72時間（B）における、エジプトネッタイシマカ幼虫（3齢幼虫）の種子粉末濃度に対する用量反応（プロビット）から推定した。点線は種子粉末処理のLC50を表す。DFP Thlaspi arvense、DFP-HT 熱失活Thlaspi arvense、IG Sinapsis alba（Ida Gold）、PG Brassica juncea（Pacific Gold）、Ls Lepidium sativum。
72 時間の評価では、DFP、IG、PG 種子ミールの LC50 値はそれぞれ 0.111、0.085、0.051 g/120 ml dH2O でした。Ls 種子ミールに曝露された幼虫はほぼすべて 72 時間後に死亡したため、死亡率データは Probit 分析と一致しませんでした。他の種子ミールと比較して、幼虫は DFP 種子ミール処理に対して感受性が低く、統計的に高い LC50 値を示しました (表 2 および 3)。72 時間後、DFP、IG、PG 種子ミール処理の LC50 値はそれぞれ 0.111、0.085、0.05 g/120 ml dH2O と推定されました。 72時間の評価後、DFP、IG、PG種子粉末のLC90値はそれぞれ0.215、0.254、0.138 g/120 ml dH2Oでした。72時間の評価後、最大濃度0.12 g/120 ml dH2OでのDFP、IG、PG種子粉末処理における幼虫の平均死亡率はそれぞれ58%、66%、96%でした（図1B）。72時間の評価後、PG種子粉末はIGおよびDFP種子粉末よりも毒性が高いことがわかりました。
合成イソチオシアネートであるアリルイソチオシアネート（AITC）、ベンジルイソチオシアネート（BITC）、および4-ヒドロキシベンジルイソチオシアネート（4-HBITC）は、蚊の幼虫を効果的に殺すことができます。処理後24時間では、BITCは幼虫に対してより毒性が高く、LC50値は5.29 ppmで、AITCの19.35 ppm、4-HBITCの55.41 ppmと比較して高くなっています（表4）。AITCおよびBITCと比較すると、4-HBITCは毒性が低く、LC50値が高くなっています。最も強力なシードミールに含まれる2つの主要なイソチオシアネート（LsおよびPG）の蚊の幼虫に対する毒性には大きな違いがあります。 AITC、BITC、および4-HBITC間のLC50値の致死量比に基づく毒性は、LC50致死量比の95%信頼区間に1の値が含まれないという統計的差異を示した（P = 0.05、表4）。BITCとAITCの両方の最高濃度は、試験した幼虫の100%を死に至らしめると推定された（図2）。
死亡率曲線は、Ae の用量反応 (プロビット) から推定されました。処理後 24 時間で、エジプトの幼虫 (3 齢幼虫) は合成イソチオシアネート濃度に達しました。点線は、イソチオシアネート処理の LC50 を表します。ベンジルイソチオシアネート BITC、アリルイソチオシアネート AITC、および 4-HBITC。
植物由来の生物農薬を蚊媒介性疾患の防除剤として利用することは、長年にわたり研究されてきた。多くの植物は殺虫活性を持つ天然化学物質を生成する37。これらの植物の生物活性化合物は、蚊を含む害虫の防除において大きな可能性を秘めた合成殺虫剤の魅力的な代替手段となる。
マスタード植物は、種子を香辛料や油の原料として利用するために栽培されています。種子からマスタードオイルを抽出したり、マスタードをバイオ燃料として利用するために抽出したりすると、副産物として脱脂種子ミールができます。この種子ミールには、多くの天然生化学成分と加水分解酵素が保持されています。この種子ミールの毒性は、イソチオシアネートの生成に起因すると考えられています。イソチオシアネートは、種子ミールの水和中に酵素ミロシナーゼによってグルコシノレートが加水分解されて生成され、殺菌作用、殺細菌作用、殺線虫作用、殺虫作用、および化学的感覚効果や化学療法特性などの他の特性があることが知られています。いくつかの研究では、マスタード植物と種子ミールが土壌や貯蔵食品の害虫に対する燻蒸剤として効果的に作用することが示されています。この研究では、4種の種子粉末とその3つの生物活性生成物であるAITC、BITC、および4-HBITCのネッタイシマカ幼虫に対する毒性を評価した。ネッタイシマカ。種子粉末を蚊の幼虫を含む水に直接加えると、蚊の幼虫に毒性のあるイソチオシアネートを生成する酵素プロセスが活性化されると予想される。この生物変換は、種子粉末の殺幼虫活性と、矮性マスタード種子粉末を加熱処理してから使用した場合に殺虫活性が失われることから部分的に実証された。加熱処理は、グルコシノレートを活性化する加水分解酵素を破壊すると予想され、それによって生物活性イソチオシアネートの生成が阻止される。これは、水生環境における蚊に対するキャベツ種子粉末の殺虫特性を確認した最初の研究である。
試験した種子粉末の中で、クレソン種子粉末（Ls）が最も毒性が強く、ネッタイシマカの死亡率を高くした。ネッタイシマカの幼虫は24時間連続処理された。残りの3つの種子粉末（PG、IG、DFP）は活性が遅く、72時間の連続処理後も有意な死亡率を引き起こした。Ls種子粉末のみが有意な量のグルコシノレートを含んでいたのに対し、PGとDFPはミロシナーゼを含み、IGは主要なグルコシノレートとしてグルコシノレートを含んでいた（表1）。グルコトロパエオリンは加水分解されてBITCになり、シナルビンは加水分解されて4-HBITC61,62になる。我々のバイオアッセイの結果は、Ls種子粉末と合成BITCの両方が蚊の幼虫に対して非常に毒性が強いことを示している。 PGとDFPの種子粉末の主成分はミロシナーゼグルコシノレートであり、これは加水分解されてAITCになります。AITCは蚊の幼虫を殺すのに効果的で、LC50値は19.35 ppmです。AITCとBITCと比較すると、4-HBITCイソチオシアネートは幼虫に対する毒性が最も低いです。AITCはBITCよりも毒性が低いものの、蚊の幼虫で試験された多くの精油よりもLC50値が低くなっています32,73,74,75。
蚊の幼虫駆除に使用する当社の十字花科種子粉末には、HPLCで測定した結果、総グルコシノレートの98～99%以上を占める主要なグルコシノレートが1種類含まれています。他のグルコシノレートは微量検出されましたが、総グルコシノレートの0.3%未満でした。クレソン（L. sativum）種子粉末には二次グルコシノレート（シニグリン）が含まれていますが、その割合は総グルコシノレートの1%であり、その含有量は依然としてごくわずかです（種子粉末1gあたり約0.4mg）。PGとDFPは同じ主要なグルコシノレート（ミロシン）を含んでいますが、LC50値が異なるため、種子粉末の殺幼虫活性は大きく異なります。うどんこ病に対する毒性は異なります。ネッタイシマカの幼虫の発生は、2種類の種子飼料間のミロシナーゼ活性または安定性の違いによるものと考えられる。ミロシナーゼ活性は、アブラナ科植物中のイソチオシアネートなどの加水分解生成物の生物学的利用能に重要な役割を果たしている76。Pocockら77およびWilkinsonら78による以前の報告では、ミロシナーゼ活性および安定性の変化は遺伝的要因および環境要因にも関連している可能性があることが示されている。
予想される生物活性イソチオシアネート含有量は、対応する化学物質処理と比較するために、各種子ミールの 24 時間および 72 時間における LC50 値に基づいて計算されました (表 5)。24 時間後、種子ミール中のイソチオシアネートは純粋な化合物よりも毒性が高くなりました。イソチオシアネート種子処理の ppm に基づいて計算された LC50 値は、BITC、AITC、および 4-HBITC 処理の LC50 値よりも低くなりました。幼虫が種子ミール ペレットを摂取しているのが観察されました (図 3A)。したがって、幼虫は種子ミール ペレットを摂取することにより、毒性イソチオシアネートに高濃度で曝露される可能性があります。これは、24 時間曝露時の IG および PG 種子ミール処理で最も顕著であり、LC50 濃度は、それぞれ純粋な AITC および 4-HBITC 処理よりも 75% および 72% 低くなりました。 LsおよびDFP処理は純粋なイソチオシアネートよりも毒性が高く、LC50値はそれぞれ24%および41%低かった。対照処理の幼虫は正常に蛹化したが（図3B）、種子粉末処理の幼虫のほとんどは蛹化せず、幼虫の発育が著しく遅れた（図3B、D）。ヨトウガ目では、イソチオシアネートは成長阻害および発育遅延と関連している79。
ネッタイシマカの幼虫を24～72時間、アブラナ科植物の種子粉末に連続的に曝露した。(A) 口器に種子粉末の粒子が付着した死んだ幼虫（丸で囲んだ部分）。(B) 対照処理（種子粉末を添加しない蒸留水）では、幼虫は正常に成長し、72時間後に蛹化を開始する。(C、D) 種子粉末で処理した幼虫。種子粉末は発育に違いを示し、蛹化しなかった。
イソチオシアネートの蚊の幼虫に対する毒性作用のメカニズムは研究されていません。しかし、アカヒアリ（Solenopsis invicta）に関するこれまでの研究では、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）およびエステラーゼ（EST）の阻害がイソチオシアネートの生物活性の主なメカニズムであることが示されており、AITCは低活性であってもアカヒアリのGST活性を阻害することができます。投与量は0.5 µg/mlです80。対照的に、AITCは成虫のトウモロコシゾウムシ（Sitophilus zeamais）のアセチルコリンエステラーゼを阻害します81。蚊の幼虫におけるイソチオシアネートの活性メカニズムを解明するために、同様の研究を行う必要があります。
我々は、植物グルコシノレートの加水分解によって反応性イソチオシアネートが形成されることが、マスタードシードミールによる蚊の幼虫の防除メカニズムであるという提案を支持するために、熱失活させたDFP処理を使用する。DFP-HTシードミールは、試験した適用量では毒性を示さなかった。Lafargaら82は、グルコシノレートは高温で分解されやすいと報告している。熱処理は、シードミール中のミロシナーゼ酵素を変性させ、グルコシノレートの加水分解による反応性イソチオシアネートの形成を防ぐことも期待される。これは、ミロシナーゼが温度感受性であることを示したOkunadeら75によっても確認されており、マスタード、ブラックマスタード、ブラッドルートの種子を80℃以上の温度にさらすと、ミロシナーゼ活性が完全に失活することが示されている。これらのメカニズムにより、熱処理したDFPシードミールの殺虫活性が失われる可能性がある。
このように、マスタードシードミールとその主要な3つのイソチオシアネートは蚊の幼虫に対して毒性があります。シードミールと化学処理とのこれらの違いを考慮すると、シードミールの使用は蚊の防除に効果的な方法となる可能性があります。シードパウダーの使用の有効性と安定性を向上させるには、適切な製剤と効果的な送達システムを特定する必要があります。私たちの結果は、マスタードシードミールが合成殺虫剤の代替として使用できる可能性を示しています。この技術は、蚊媒介生物を制御するための革新的なツールになる可能性があります。蚊の幼虫は水生環境で繁殖し、シードミールのグルコシノレートは水和時に酵素的に活性イソチオシアネートに変換されるため、蚊が蔓延している水にマスタードシードミールを使用することで、大きな防除効果が期待できます。イソチオシアネートの殺幼虫活性は様々であるが（BITC > AITC > 4-HBITC）、種子粕と複数のグルコシノレートを組み合わせることで相乗的に毒性が増加するかどうかを判断するには、さらなる研究が必要である。本研究は、脱脂アブラナ科種子粕と3種類の生物活性イソチオシアネートの蚊に対する殺虫効果を実証した最初の研究である。本研究の結果は、種子から油を抽出する際の副産物である脱脂キャベツ種子粕が、蚊の防除に有望な殺幼虫剤として利用できる可能性を示しており、新たな地平を切り開くものである。この情報は、植物由来の生物防除剤の発見と、安価で実用的かつ環境に優しい生物農薬としての開発をさらに進めるのに役立つだろう。
本研究で生成されたデータセットおよび分析結果は、合理的な要請があれば、責任著者から入手可能です。研究終了後、研究で使用したすべての材料（昆虫および種子粉末）は廃棄されました。
投稿日時：2024年7月29日
