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植物由来の殺虫化合物の組み合わせは、害虫に対して相乗作用または拮抗作用を示す可能性があります。ネッタイシマカ（Aedes属）が媒介する病気の急速な蔓延と、従来の殺虫剤に対するネッタイシマカの耐性の高まりを踏まえ、植物精油をベースとしたテルペン化合物28種類の組み合わせが調合され、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）の幼虫および成虫に対する有効性が試験されました。まず、5種類の植物精油（EO）について、幼虫駆除効果および成虫に対する有効性を評価し、GC-MS分析の結果に基づき、各EOに2つの主要化合物を同定しました。同定された主な化合物は、ジアリルジスルフィド、ジアリルトリスルフィド、カルボン、リモネン、オイゲノール、メチルオイゲノール、ユーカリプトール、ユーデスモール、および蚊α-ピネンであり、購入して使用しました。これらの化合物を致死量未満で2成分配合し、相乗効果および拮抗効果を試験・判定しました。幼虫駆除効果に最も優れた組成物はリモネンとジアリルジスルフィドを混合することで得られ、成虫駆除効果に最も優れた組成物はカルボンとリモネンを混合することで得られました。市販の合成幼虫駆除剤テンホスと成虫駆除剤マラチオンを、それぞれ単独で、およびテルペノイドとの2成分配合で試験しました。その結果、テメホスとジアリルジスルフィド、およびマラチオンとオイデスモールの配合が最も効果的であることが示されました。これらの強力な配合は、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）駆除に使用できる可能性があります。
植物精油（EO）は、様々な生理活性化合物を含む二次代謝産物であり、合成殺虫剤の代替としてますます重要になっています。環境に優しく、使用者にも優しいだけでなく、異なる生理活性化合物の混合物であるため、薬剤耐性の発現リスクを低減します1。研究者らはGC-MS技術を用いて、様々な植物精油の成分を分析し、17,500種の芳香植物から3,000種以上の化合物を特定しました2。これらの化合物のほとんどについて殺虫活性試験が行われ、殺虫効果が報告されています3,4。一部の研究では、この化合物の主成分の毒性は、粗エチレンオキシドと同等かそれ以上であることが示されています。しかし、個々の化合物の使用は、化学殺虫剤の場合と同様に、耐性発現の可能性を残す可能性があります5,6。そのため、現在、エチレンオキシド系化合物の混合物を調製することで殺虫効果を高め、標的害虫集団における耐性発現リスクを低減することに焦点が当てられています。精油に含まれる個々の活性化合物は、組み合わせることで相乗効果または拮抗効果を示し、EOの全体的な活性を反映します。この事実は、以前の研究者による研究で十分に強調されています7,8。ベクターコントロールプログラムには、EOとその成分も含まれます。精油の蚊駆除活性は、イエカおよびハマダラカにおいて広範に研究されてきました。いくつかの研究では、さまざまな植物と市販の合成殺虫剤を組み合わせることで全体的な毒性を高め、副作用を最小限に抑え、効果的な殺虫剤の開発が試みられました9。しかし、そのような化合物のネッタイシマカに対する研究は依然としてまれです。医学の進歩と薬剤およびワクチンの開発は、一部のベクター媒介性疾患の対策に役立っています。しかし、ネッタイシマカによって媒介されるウイルスの異なる血清型の存在は、ワクチン接種プログラムの失敗につながっています。したがって、そのような疾患が発生した場合、ベクターコントロールプログラムが、病気の蔓延を防ぐ唯一の選択肢となります。現状では、デング熱、ジカ熱、デング出血熱、黄熱病などを引き起こすさまざまなウイルスとその血清型の重要なベクターであるネッタイシマカの制御が非常に重要です。最も注目すべきことは、ほぼすべてのベクター媒介性ネッタイシマカ媒介性疾患の症例数がエジプトで毎年増加しており、世界中でも増加しているという事実です。したがって、このような状況では、ネッタイシマカの個体群に対する環境に優しく効果的な制御対策の開発が緊急に必要です。この点で潜在的な候補は、EO、その構成化合物、およびそれらの組み合わせです。したがって、本研究では、ネッタイシマカに対する殺虫特性を持つ5種類の植物（ミント、ホーリーバジル、ユーカリ斑点、アリウムサルファ、メラレウカ）から主要な植物EO化合物の効果的な相乗組み合わせを特定しようと試みました。
選択された全てのEOは、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）に対して潜在的な殺幼虫活性を示し、24時間LC50は0.42～163.65 ppmでした。最も高い殺幼虫活性を示したのはペパーミント（Mp）EOで、24時間LC50は0.42 ppmでした。次いでニンニク（As）EOで、24時間LC50は16.19 ppmでした（表1）。
オキシムム・サントゥム（Os）EOを除く、スクリーニングされた他の4つのEOはすべて明らかな殺アレルギー作用を示し、24時間曝露期間におけるLC50値は23.37～120.16 ppmでした。チモフィルス・ストライタ（Cl）EOは、曝露後24時間以内に成虫を最も効果的に殺し、LC50値は23.37 ppmでした。次いでユーカリプタス・マキュラータ（Em）のLC50値は101.91 ppmでした（表1）。一方、OsのLC50値は、最高用量で53%という最高の死亡率が記録されたため、まだ決定されていません（補足図3）。
各EOの主要構成化合物2種は、NISTライブラリデータベースの結果、GCクロマトグラム面積率、およびMSスペクトルの結果に基づいて同定・選択された（表2）。EO Asでは、ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドが主要化合物として同定された。EO Mpでは、カルボンとリモネンが主要化合物として同定された。EO Emでは、オイデスモールとユーカリプトールが主要化合物として同定された。EO Osでは、オイゲノールとメチルオイゲノールが主要化合物として同定された。EO Clでは、オイゲノールとα-ピネンが主要化合物として同定された（図1、補足図5～8、補足表1～5）。
選択したエッセンシャルオイルの主なテルペノイドの質量分析の結果（A-ジアリルジスルフィド、B-ジアリルトリスルフィド、C-オイゲノール、D-メチルオイゲノール、E-リモネン、F-芳香族セペロン、G-α-ピネン、H-シネオール、R-オイダモール）。
EOの主成分である有効な化合物として、合計9つの化合物（ジアリルジスルフィド、ジアリルトリスルフィド、オイゲノール、メチルオイゲノール、カルボン、リモネン、ユーカリプトール、オイデスモール、α-ピネン）が特定され、幼虫期のネッタイシマカに対して個別に生物学的検定が行われた。 化合物オイデスモールは、24時間暴露後のLC50値が2.25 ppmで最も高い殺幼虫活性を示した。 化合物ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドも潜在的な殺幼虫作用があることが判明しており、平均亜致死量は10～20 ppmの範囲である。 化合物オイゲノール、リモネン、ユーカリプトールでも中程度の殺幼虫活性が観察され、LC50値はそれぞれ63.35 ppm、139.29 ppmであった。 24時間後、それぞれ1.5ppmおよび181.33ppmであった（表3）。しかし、メチルオイゲノールおよびカルボンは、最高用量においても有意な幼虫殺虫能を示さなかったため、LC50値は算出しなかった（表3）。合成幼虫駆除剤テメホスは、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）に対する24時間曝露後の平均致死濃度は0.43ppmであった（表3、補足表6）。
7つの化合物（ジアリルジスルフィド、ジアリルトリスルフィド、ユーカリプトール、α-ピネン、ユーデスモール、リモネン、カルボン）が有効なEOの主要化合物として特定され、エジプトネッタイシマカ成虫に対して個別に試験された。プロビット回帰分析によると、24時間曝露時間で、ユーデスモールのLC50値が1.82 ppmで最も高い毒性を示し、次いでユーカリプトールのLC50値が17.60 ppmであった。試験された残りの5つの化合物は、成虫に対して中程度の毒性を示し、LC50値は140.79～737.01 ppmであった（表3）。合成有機リン化合物であるマラチオンは、ユーデスモールよりも毒性は低いが、他の6つの化合物よりも毒性が強く、24時間曝露時間でのLC50値は5.44 ppmであった（表3、補足表6）。
7種類の強力なリード化合物と有機リン化合物のタメホサートを選定し、LC50用量を1:1の比率で配合した。合計28種類の配合を調製し、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）に対する幼虫駆除効果を試験した。9種類は相乗効果、14種類は拮抗効果、5種類は幼虫駆除効果を示さなかった。相乗効果を示した配合の中では、ジアリルジスルフィドとテモフォールの配合が最も効果的で、24時間後に100%の死亡率が観察された（表4）。同様に、リモネンとジアリルジスルフィド、およびオイゲノールとチメトホスの混合液も良好な効果を示し、幼虫の死亡率は98.3%であった（表5）。残りの4つの組み合わせ、すなわちオイデスモールとユーカリプトール、オイデスモールとリモネン、ユーカリプトールとα-ピネン、α-ピネンとテメホスも、幼虫駆除効果が大きく、死亡率は90%を超えました。予測死亡率は60～75%程度です（表4）。しかし、リモネンとα-ピネンまたはユーカリとの組み合わせは拮抗作用を示しました。同様に、テメホスとオイゲノールまたはユーカリ、オイデスモールまたはジアリルトリスルフィドとの混合物も拮抗作用を示すことが分かっています。同様に、ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドの組み合わせ、およびこれらの化合物のいずれかとオイデスモールまたはオイゲノールとの組み合わせも、幼虫駆除作用において拮抗作用を示します。オイデスモールとオイゲノールまたはα-ピネンの組み合わせでも拮抗作用が報告されています。
成虫に対する酸性活性を試験した全28種の二成分混合物のうち、7種の組み合わせは相乗効果を示し、6種は効果がなく、15種は拮抗効果を示した。ユーデスモールとユーカリ、およびリモネンとカルボンの混合物は、他の相乗効果を示す組み合わせよりも効果的であることが確認され、24時間後の死亡率はそれぞれ76%と100%であった（表5）。マラチオンは、リモネンとジアリルトリスルフィドを除くすべての化合物の組み合わせで相乗効果を示すことが観察されている。一方、ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドは、ユーカリ、ユーカリプトール、カルボン、またはリモネンとの組み合わせと拮抗作用を示した。同様に、α-ピネンとオイデスモールまたはリモネン、ユーカリプトールとカルボンまたはリモネン、リモネンとオイデスモールまたはマラチオンの組み合わせでも、拮抗的な幼虫駆除効果が認められました。残りの6つの組み合わせでは、期待死亡率と実測死亡率に有意差は認められませんでした（表5）。
相乗効果と亜致死量に基づき、最終的に多数のネッタイシマカ（Aedes aegypti）に対する幼虫駆除毒性が選択され、さらに試験が行われた。その結果、オイゲノール-リモネン、ジアリルジスルフィド-リモネン、ジアリルジスルフィド-チメホスの2成分配合において観察された幼虫死亡率は100%であったのに対し、予測された幼虫死亡率はそれぞれ76.48%、72.16%、63.4%であった（表6）。リモネンとオイデスモールの配合は比較的効果が低く、24時間の曝露期間中に88%の幼虫死亡率が観察された（表6）。まとめると、選択された4つの2成分配合は、大規模に適用された場合、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）に対する相乗的な幼虫駆除効果も示した（表6）。
成虫のネッタイシマカの大規模な個体群を駆除するための成虫駆除生物検定では、相乗効果のある3つの組み合わせが選択されました。大型昆虫コロニーで試験する組み合わせを選択するために、まず、相乗効果が最も高いテルペンの組み合わせ2つ、すなわちカルボンとリモネン、およびユーカリプトールとオイデスモールに注目しました。次に、合成有機リン化合物のマラチオンとテルペノイドの組み合わせから、相乗効果が最も高い組み合わせが選択されました。候補成分の最も高い死亡率と非常に低いLC50値により、マラチオンとオイデスモールの組み合わせが大型昆虫コロニーでの試験に最適な組み合わせであると考えられます。マラチオンは、α-ピネン、ジアリルジスルフィド、ユーカリ、カルボン、およびオイデスモールとの組み合わせで相乗効果を示します。しかし、LC50値を見ると、オイデスモールの値が最低値（2.25 ppm）となっています。マラチオン、α-ピネン、ジアリルジスルフィド、ユーカリプトール、カルボンの計算されたLC50値は、それぞれ5.4、716.55、166.02、17.6、140.79 ppmでした。これらの値は、マラチオンとユーデスモールの組み合わせが、投与量の点で最適な組み合わせであることを示しています。結果は、カルボンとリモネン、およびユーデスモールとマラチオンの組み合わせで、観測された死亡率が100%であったのに対し、予測死亡率は61%～65%であることを示しました。もう1つの組み合わせであるユーデスモールとユーカリプトールの組み合わせでは、24時間の暴露後に死亡率が78.66%であったのに対し、予測死亡率は60%でした。選択された3つの組み合わせはすべて、成虫のネッタイシマカに対して大規模に適用された場合でも相乗効果を示しました（表6）。
本研究では、Mp、As、Os、Em、Clなどの厳選された植物由来のEOが、ネッタイシマカの幼虫および成虫に対して有望な致死効果を示しました。Mp EOはLC50値が0.42 ppmと最も高い殺幼虫活性を示し、次いでAs、Os、Em EOが24時間後のLC50値が50 ppm未満でした。これらの結果は、蚊やその他の双翅目ハエに関する過去の研究10,11,12,13,14と一致しています。Clの幼虫殺虫効力は他の精油よりも低く、LC50値は24時間後に163.65 ppmですが、成虫に対する効力は最も高く、LC50値は24時間後に23.37 ppmでした。 Mp、As、Em EO も、24 時間暴露で LC50 値が 100～120 ppm の範囲で優れた殺アレルギー能を示しましたが、幼虫駆除効果に比べると相対的に低かったです。一方、EO O は、最高の治療用量でも無視できるほどの殺アレルギー効果を示しました。このように、結果は、植物に対するエチレンオキシドの毒性は、蚊の発育段階によって異なる可能性があることを示しています15。それはまた、昆虫の体内への EO の浸透速度、特定の標的酵素との相互作用、および各発育段階の蚊の解毒能力にも依存します16。多数の研究により、主成分化合物がエチレンオキシドの生物学的活性において重要な要因であることが示されています。なぜなら、それが全化合物の大部分を占めるからです3,12,17,18。したがって、各 EO で 2 つの主化合物を考慮しました。 GC-MS の結果に基づいて、ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドが EO As の主要化合物として特定され、これは以前の報告 19,20,21 と一致しています。以前の報告ではメントールが主要化合物の 1 つであると示されていましたが、カルボンとリモネンが再び Mp EO の主要化合物として特定されました22,23。Os EO の組成プロファイルは、オイゲノールとメチルオイゲノールが主要化合物であることを示しており、これは以前の研究者 16,24 の調査結果と類似しています。ユーカリプトールとユーカリプトールは Em 葉油に存在する主要化合物として報告されていますが、これは一部の研究者 25,26 の調査結果と一致していますが、Olalade ら 27 の調査結果とは矛盾しています。シネオールと α-ピネンの優位性はメラレウカ精油で観察され、これは以前の研究 28,29 と類似しています。異なる場所にある同じ植物種から抽出された精油の組成と濃度の種内差異は報告されており、本研究でも観察されました。これは、地理的な植物生育条件、収穫時期、発育段階、または植物の年齢、化学型の出現などによって影響を受けます22,30,31,32。次に、特定された主要な化合物を購入し、幼虫駆除効果と成虫のネッタイシマカに対する効果をテストしました。結果は、ジアリルジスルフィドの幼虫駆除活性が粗EO Asのそれに匹敵することを示しました。しかし、ジアリルトリスルフィドの活性はEO Asよりも高いことが示されました。これらの結果は、Kimbaris et al. 33 がCulex philippinesに対して得た結果と同様です。ただし、これら2つの化合物は標的の蚊に対して良好な自己駆除活性を示さず、これはPlata-Rueda et al 34 がTenebrio molitorに対して行った結果と一致しています。 Os EOはネッタイシマカの幼虫期には有効だが、成虫期には効果がない。主要化合物個々の殺幼虫活性は粗Os EOよりも低いことが確認されている。これは、粗エチレンオキシド中の他の化合物とそれらの相互作用が役割を果たしていることを示唆している。メチルオイゲノール単独では活性が無視できるのに対し、オイゲノール単独では中程度の殺幼虫活性がある。この結論は、一方では35,36、以前の研究者の結論を裏付けるものであり、他方では37,38、以前の研究者の結論と矛盾する。オイゲノールとメチルオイゲノールの官能基の違いが、同じ標的昆虫に対して異なる毒性をもたらす可能性がある39。リモネンは中程度の殺幼虫活性があることが判明したが、カルボンの効果はわずかだった。同様に、成虫に対するリモネンの比較的低い毒性とカルボンの高い毒性は、いくつかの以前の研究40の結果を支持する一方で、他の研究41と矛盾している。環内および環外の両方の位置に二重結合が存在することで、これらの化合物の殺幼虫剤としての利点が増加する可能性があります3,41。一方、不飽和アルファおよびベータ炭素を持つケトンであるカルボンは、成虫に対する毒性の可能性が高くなる可能性があります42。ただし、リモネンとカルボンの個々の特性は、EO Mp 全体よりもはるかに低いです (表 1、表 3)。 試験したテルペノイドの中で、オイデスモールは、LC50 値が 2.5 ppm 未満で、幼虫と成虫に対する最大の活性を示し、ヤブカ科蚊の駆除に有望な化合物となっています。その性能は EO Em 全体の性能よりも優れていますが、これは Cheng らの調査結果とは一致しません40。オイデスモールは、2 つのイソプレン単位を持つセスキテルペンで、ユーカリなどの酸素化モノテルペンよりも揮発性が低いため、殺虫剤としての可能性が高いです。ユーカリプトール自体は、幼虫駆除効果よりも成虫駆除効果の方が大きく、以前の研究結果はこれを支持するとともに反証もしている37,43,44。その活性のみでは、EO Cl全体の活性にほぼ匹敵する。別の二環式モノテルペンであるα-ピネンは、ネッタイシマカに対する成虫駆除効果よりも幼虫駆除効果が低く、これはEO Cl全体の効果とは逆である。テルペノイドの全体的な殺虫活性は、親油性、揮発性、炭素分岐、投影面積、表面積、官能基およびその位置によって影響を受ける45,46。これらの化合物は、細胞蓄積の破壊、呼吸活動の阻害、神経インパルスの伝達の中断などによって作用する可能性がある。47 合成有機リン化合物のテメホスは、LC50値が0.43 ppmで最も高い幼虫駆除活性を示すことがわかったが、これはLekのデータ -Utala48と一致している。合成有機リン系マラチオンの成虫に対する活性は5.44ppmと報告されています。これら2つの有機リン系殺虫剤は、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）の実験系統に対して良好な反応を示しましたが、世界各地でこれらの化合物に対する蚊の耐性が報告されています49。しかしながら、生薬に対する耐性の発達に関する同様の報告は見つかっていません50。したがって、植物性殺虫剤は、媒介生物防除プログラムにおいて化学農薬の潜在的な代替手段と考えられています。
強力なテルペノイドとテルペノイドとチメトホスから調製した28の2元配合（1:1）について、幼虫駆除効果を試験したところ、9つの組み合わせで相乗効果、14つで拮抗効果、5つで拮抗効果が認められました。一方、成虫に対する効力試験では、7つの組み合わせで相乗効果、15つの組み合わせで拮抗効果が認められ、6つの組み合わせでは効果がないと報告されました。特定の組み合わせが相乗効果を生み出す理由は、候補化合物が異なる重要な経路で同時に相互作用するため、または特定の生物学的経路の異なる主要酵素を順次阻害するためである可能性があります51。リモネンとジアリルジスルフィド、ユーカリ、またはオイゲノールとの組み合わせは、小規模および大規模の両方の適用において相乗効果があることがわかった（表 6）のに対し、ユーカリまたは α-ピネンとの組み合わせは幼虫に対して拮抗作用を示すことがわかった。平均して、リモネンは、メチル基の存在、角質層への良好な浸透、および異なる作用機序により、良好な相乗作用を示すと思われる52,53。これまでに、リモネンは昆虫のクチクラを貫通して毒性作用（接触毒性）、消化器系に影響を及ぼす（摂食阻害作用）、または呼吸器系に影響を及ぼす（燻蒸作用）可能性があることが報告されている54。一方、オイゲノールなどのフェニルプロパノイドは代謝酵素に影響を及ぼす可能性がある55。したがって、作用機序の異なる化合物を組み合わせると、混合物の全体的な致死効果が増大する可能性がある。ユーカリプトールはジアリルジスルフィド、ユーカリ、またはα-ピネンと相乗効果があることが確認されましたが、他の化合物との組み合わせでは幼虫駆除効果が得られないか、拮抗作用を示しました。初期の研究では、ユーカリプトールはアセチルコリンエステラーゼ（AChE）だけでなく、オクタアミン受容体およびGABA受容体にも阻害作用を示すことが示されました56。環状モノテルペン、ユーカリプトール、オイゲノールなどは、神経毒性活性と同じ作用機序を有する可能性があるため57、相互阻害によって併用効果を最小限に抑えることができます。同様に、テメホスとジアリルジスルフィド、α-ピネン、リモネンの組み合わせは相乗効果があることが確認されており、ハーブ製品と合成有機リン化合物の相乗効果に関する過去の報告を裏付けています58。
オイデスモールとユーカリプトールの組み合わせは、ネッタイシマカの幼虫と成虫に対して相乗効果があることがわかっています。これは、それらの異なる化学構造による異なる作用機序によるものと考えられます。オイデスモール (セスキテルペン) は呼吸器系 59 に影響を及ぼし、ユーカリプトール (モノテルペン) はアセチルコリンエステラーゼ 60 に影響を及ぼす可能性があります。2 つ以上の標的部位にこれらの成分が同時に曝露されると、組み合わせによる全体的な致死効果が増強される可能性があります。成虫物質の生物学的検定では、マラチオンはカルボン、ユーカリプトール、ジアリルジスルフィド、または α-ピネンと相乗効果があることがわかっており、リモネンおよびジスルフィドの添加と相乗効果があることを示しています。アリルトリスルフィドを除くテルペン化合物のポートフォリオ全体は、相乗効果のあるアレルギー抑制剤の候補として優れています。 ThangamとKathiresan61も、マラチオンとハーブエキスの相乗効果について同様の結果を報告しています。この相乗効果は、マラチオンと植物化学物質が昆虫の解毒酵素に及ぼす複合的な毒性作用によるものと考えられます。マラチオンなどの有機リン化合物は、一般的にシトクロムP450エステラーゼおよびモノオキシゲナーゼを阻害することで作用します62,63,64。したがって、これらの作用機序を持つマラチオンと、異なる作用機序を持つテルペンを併用することで、蚊に対する全体的な致死効果を高める可能性があります。
一方、拮抗作用は、選択された化合物の組み合わせでは、各化合物単独よりも活性が低いことを示します。いくつかの組み合わせで拮抗作用が生じる理由は、1 つの化合物が、吸収、分布、代謝、または排泄の速度を変えることによって、他の化合物の挙動を変更することが原因である可能性があります。初期の研究者は、これが薬物の組み合わせにおける拮抗作用の原因であると考えました。分子 考えられるメカニズム 65。同様に、拮抗作用の考えられる原因は、同様の作用機序、同じ受容体または標的部位に対する構成化合物の競合に関連している可能性があります。場合によっては、標的タンパク質の非競合的阻害も発生する可能性があります。この研究では、ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドの 2 つの有機硫黄化合物が拮抗作用を示しましたが、これは同じ標的部位に対する競合によるものと考えられます。同様に、これら 2 つの硫黄化合物は拮抗作用を示し、オイデスモールおよび α-ピネンと組み合わせた場合は効果がありませんでした。オイデスモールとα-ピネンは本質的に環状ですが、ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドは本質的に脂肪族です。化学構造に基づくと、これらの化合物の組み合わせは通常標的部位が異なるため、全体的な致死活性を高めるはずです34,47が、実験では拮抗作用が見られました。これは、これらの化合物が生体内でいくつかの未知の生物で役割を果たしているためかもしれません。同様に、シネオールとα-ピネンの組み合わせは拮抗反応を引き起こしましたが、研究者らは以前にこの2つの化合物が異なる作用標的を持っていると報告しました47,60。両方の化合物は環状モノテルペンであるため、結合を競い合い、研究対象の組み合わせの全体的な毒性に影響を及ぼす可能性のある共通の標的部位がいくつかある可能性があります。
LC50値と死亡率に基づき、最も相乗効果の高い2つのテルペン化合物の組み合わせ、すなわちカルボン＋リモネンとユーカリプトール＋オイデスモール、およびテルペンを含む合成有機リン化合物マラチオンが選定されました。マラチオン＋オイデスモール化合物の最適な相乗効果の組み合わせは、成虫殺虫剤を用いた生物検定で試験されました。これらの効果的な組み合わせが、比較的広い曝露空間における多数の個体に対して有効かどうかを確認するため、大規模な昆虫コロニーを対象としました。これらの組み合わせはすべて、大規模な昆虫群に対して相乗効果を示しました。ネッタイシマカの幼虫の大規模な集団に対して試験した最適な相乗効果のある幼虫駆除剤の組み合わせでも同様の結果が得られました。したがって、植物由来のEO化合物の効果的な相乗効果を持つ殺幼虫剤と殺成虫剤の組み合わせは、既存の合成化学物質に代わる有力な候補であり、ネッタイシマカの個体群制御にも活用できると言える。同様に、合成殺幼虫剤または殺成虫剤とテルペンの効果的な組み合わせは、蚊に投与されるチメトホスまたはマラチオンの投与量を減らすためにも利用できる。これらの強力な相乗効果の組み合わせは、ヤブカ属（Aedes aegypti）の薬剤耐性の進化に関する将来の研究に解決策をもたらす可能性がある。
ネッタイシマカ（Aedes aegypti）の卵は、インド医学研究評議会（Indian Council of Medical Research）のディブルガール地域医学研究センターから採取され、ガウハティ大学動物学部において、温度（28 ± 1 °C）と湿度（85 ± 5%）が管理された環境下で、以下の条件で保管されました。アリヴォリは、孵化後、幼虫には幼虫用飼料（ドッグビスケットパウダーとイーストを3:1の割合で混ぜたもの）を与え、成虫には10%のブドウ糖溶液を与えました。羽化後3日目から、成虫の雌蚊にアルビノラットの血を吸わせました。濾紙をグラスに入れた水に浸し、産卵ケージに入れます。
選定された植物サンプルは、ユーカリの葉（フトモモ科）、ホーリーバジル（シソ科）、ミント（シソ科）、メラレウカ（フトモモ科）、アリウムの球根（ヒガンバナ科）。グワハティで採取され、グワハティ大学植物学科によって同定された。採取された植物サンプル（500g）は、クレベンジャー蒸留装置を用いて6時間、水蒸気蒸留された。抽出されたEOは清潔なガラスバイアルに集められ、更なる研究のために4℃で保存された。
幼虫駆除毒性は、わずかに改変した世界保健機関の標準手順 67 を使用して研究されました。 DMSO を乳化剤として使用します。各 EO 濃度は、最初に 100 および 1000 ppm でテストされ、各反復で 20 匹の幼虫が曝露されました。結果に基づいて濃度範囲が適用され、処理後 1 時間から 6 時間 (1 時間間隔)、および 24 時間、48 時間、72 時間で死亡率が記録されました。亜致死濃度 (LC50) は、曝露後 24、48、72 時間後に測定されました。各濃度は、1 つのネガティブ コントロール (水のみ) と 1 つのポジティブ コントロール (DMSO 処理水) とともに 3 連で分析されました。蛹化が起こり、コントロール グループの幼虫の 10% 以上が死亡した場合は、実験を繰り返します。コントロール グループの死亡率が 5-10% の間の場合は、Abbott 補正式 68 を使用します。
Ramar et al. 69 によって記載された方法を使用して、アセトンを溶媒として用いて、ネッタイシマカ成虫に対する生物学的検定を行った。各EOは、まず100および1000 ppmの濃度でネッタイシマカ成虫に対して試験された。調製した各溶液2 mlをWhatman数に塗布した。ろ紙1枚（サイズ12 x 15 cm2）に塗布し、アセトンを10分間蒸発させた。アセトン2 mlのみで処理したろ紙を対照として使用した。アセトンが蒸発した後、処理済みろ紙と対照ろ紙を円筒形のチューブ（深さ10 cm）に入れた。3〜4日齢の吸血していない蚊10匹を各濃度の3連に移した。予備試験の結果に基づいて、選択したオイルのさまざまな濃度を試験した。蚊の放出後1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、24時間、48時間、72時間で死亡率を記録しました。24時間、48時間、72時間の曝露時間におけるLC50値を算出します。対照群の死亡率が20%を超える場合は、試験全体を繰り返します。同様に、対照群の死亡率が5%を超える場合は、アボットの式68を用いて処理サンプルの結果を調整します。
ガスクロマトグラフィー（Agilent 7890A）および質量分析（Accu TOF GCv、Jeol）を用いて、選択した精油の成分を分析した。GCにはFID検出器とキャピラリーカラム（HP5-MS）を装備した。キャリアガスはヘリウム、流量は1 ml/分であった。 GC プログラムは、Allium sativum を 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M、Ocimum Sainttum を 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280 に設定し、ミントの場合は 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280、ユーカリの場合は 20.60-1M-10-200-3M-30-280、赤の場合は 10:60-1M-8-220-5M-8-270-3M となります。
各 EO の主要化合物は、GC クロマトグラムと質量分析結果 (NIST 70 標準データベースを参照) から計算された面積パーセンテージに基づいて特定されました。
各EOに含まれる2つの主要化合物は、GC-MSの結果に基づいて選択され、更なる生物検定のためにシグマアルドリッチから純度98～99%で購入された。これらの化合物は、上述の通り、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）に対する幼虫駆除効果および成虫駆除効果について試験された。最も一般的に使用されている合成幼虫駆除剤であるタメホサート（シグマアルドリッチ）および成虫駆除剤であるマラチオン（シグマアルドリッチ）についても、同様の手順で分析し、選択されたEO化合物との有効性を比較した。
選定したテルペン化合物、およびテルペン化合物と市販の有機リン系殺虫剤（タイレホスおよびマラチオン）の2成分混合物を、各候補化合物のLC50用量を1:1の比率で混合することにより調製した。調製した混合物は、前述の通り、ネッタイシマカの幼虫および成虫に対して試験した。各生物学的試験は、各組み合わせについて3回ずつ、また各組み合わせに含まれる個々の化合物についても3回ずつ実施した。標的昆虫の死亡は24時間後に記録した。以下の式を用いて、2成分混合物の予測死亡率を計算しなさい。
ここで、E はバイナリー組み合わせ、つまり接続 (A + B) に対するネッタイシマカの予想死亡率です。
各2成分混合物の効果は、Pavla52によって記載された方法で計算されたχ2値に基づいて、相乗効果、拮抗効果、または効果なしと分類されました。各組み合わせのχ2値は、次の式を用いて計算してください。
組み合わせの効果は、計算されたχ2値が対応する自由度（95%信頼区間）における表の値より大きく、かつ観測された死亡率が期待死亡率を上回った場合に相乗的であると定義されました。同様に、いずれかの組み合わせにおいて計算されたχ2値が一部の自由度において表の値を超えているものの、観測された死亡率が期待死亡率より低い場合、その治療は拮抗的であるとみなされます。また、いずれかの組み合わせにおいて計算されたχ2値が対応する自由度における表の値より小さい場合、その組み合わせは効果がないものとみなされます。
多数の昆虫に対する試験を行うため、相乗効果がある可能性のある3～4種の組み合わせ（幼虫100匹と殺幼虫および成虫活性50匹）を選択した。成虫）は上記のように進める。混合物とともに、選択した混合物中に存在する個々の化合物も同数のネッタイシマカの幼虫と成虫で試験した。組み合わせ比率は、1つの候補化合物のLC50用量と他の構成化合物のLC50用量の一部である。成虫活性バイオアッセイでは、選択した化合物を溶媒アセトンに溶解し、1300 cm3の円筒形プラスチック容器に包んだろ紙に塗布した。アセトンを10分間蒸発させ、成虫を放した。同様に、殺幼虫バイオアッセイでは、LC50候補化合物の用量を最初に等量のDMSOに溶解し、次に1300 ccのプラスチック容器に保存した1リットルの水と混合し、幼虫を放した。
SPSS (バージョン 16) および Minitab ソフトウェアを使用して、記録された 71 件の死亡率データの確率分析を実行し、LC50 値を計算しました。
投稿日時: 2024年7月1日