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植物由来の殺虫化合物の組み合わせは、害虫に対して相乗的または拮抗的な相互作用を示す可能性がある。ネッタイシマカが媒介する病気の急速な蔓延と、ネッタイシマカの個体群の従来の殺虫剤に対する抵抗性の増加を考慮して、植物精油に基づくテルペン化合物の28の組み合わせが処方され、ネッタイシマカの幼虫期と成虫期に対して試験された。5種類の植物精油（EO）が最初に幼虫および成虫に対する有効性について評価され、GC-MSの結果に基づいて各EOで2つの主要な化合物が特定された。特定された主な化合物、すなわちジアリルジスルフィド、ジアリルトリスルフィド、カルボン、リモネン、オイゲノール、メチルオイゲノール、ユーカリプトール、ユーデスモール、および蚊のα-ピネンが購入された。次に、これらの化合物の二成分混合物を致死量以下の用量で調製し、それらの相乗効果と拮抗効果を試験し決定した。最も効果的な幼虫駆除組成物はリモネンとジアリルジスルフィドを混合することで得られ、最も効果的な成虫駆除組成物はカルボンとリモネンを混合することで得られた。市販の合成幼虫駆除剤であるテムホスと成虫駆除剤であるマラチオンを、それぞれ単独で、またテルペノイドとの二成分混合物として試験した。その結果、テムホスとジアリルジスルフィド、およびマラチオンとユーデスモールの組み合わせが最も効果的な組み合わせであることが示された。これらの強力な組み合わせは、ネッタイシマカに対する使用の可能性を秘めている。
植物精油（EO）は、さまざまな生物活性化合物を含む二次代謝産物であり、合成殺虫剤の代替品としてますます重要になっています。これらは環境に優しく、使いやすいだけでなく、さまざまな生物活性化合物の混合物でもあるため、薬剤耐性の発生の可能性も低くなります1。GC-MS技術を使用して、研究者はさまざまな植物精油の成分を調べ、17,500の芳香植物から3,000以上の化合物を特定しました2。これらの化合物のほとんどは殺虫特性についてテストされ、殺虫効果があると報告されています3,4。いくつかの研究では、化合物の主成分の毒性は、粗エチレンオキシドの毒性と同等かそれ以上であることが強調されています。しかし、個々の化合物を使用すると、化学殺虫剤の場合と同様に、耐性が発生する余地が残る可能性があります5,6。したがって、現在の焦点は、エチレンオキシドベースの化合物の混合物を調製して殺虫効果を高め、標的害虫集団の耐性の可能性を低減することです。精油に含まれる個々の活性化合物は、精油の全体的な活性を反映して、組み合わせると相乗効果または拮抗効果を示す可能性があり、この事実は以前の研究者によって行われた研究で十分に強調されています7,8。ベクター制御プログラムには、精油とその成分も含まれます。精油の殺蚊活性は、イエカとハマダラカで広く研究されています。いくつかの研究では、さまざまな植物と市販の合成殺虫剤を組み合わせて全体的な毒性を高め、副作用を最小限に抑えることで、効果的な殺虫剤を開発しようと試みてきました9。しかし、ネッタイシマカに対するそのような化合物の研究は依然としてまれです。医学の進歩と医薬品およびワクチンの開発は、いくつかのベクター媒介性疾患との戦いに役立っています。しかし、ネッタイシマカによって媒介されるウイルスのさまざまな血清型の存在により、ワクチン接種プログラムが失敗しています。したがって、そのような疾患が発生した場合、ベクター制御プログラムは、病気の蔓延を防ぐ唯一の選択肢です。現在の状況では、ネッタイシマカはデング熱、ジカ熱、デング出血熱、黄熱病などを引き起こす様々なウイルスとその血清型の主要な媒介者であるため、ネッタイシマカの制御は非常に重要です。最も注目すべき点は、エジプトではほぼすべてのネッタイシマカ媒介性疾患の症例数が毎年増加しており、世界的にも増加しているという事実です。したがって、このような状況では、ネッタイシマカの個体群に対する環境に優しく効果的な制御対策を開発することが緊急に必要です。この点で有望な候補は、精油、その構成化合物、およびそれらの組み合わせです。そこで、本研究では、殺虫特性を持つ5種類の植物（ミント、ホーリーバジル、ユーカリ・スポッテッド、アリウム・サルファー、メラレウカ）の主要な植物精油化合物のネッタイシマカに対する効果的な相乗効果の組み合わせを特定しようと試みました。
選択されたすべての精油は、ネッタイシマカに対する潜在的な殺幼虫活性を示し、24時間LC50値は0.42～163.65 ppmの範囲であった。最も高い殺幼虫活性はペパーミント（Mp）精油で記録され、24時間LC50値は0.42 ppmであり、次いでニンニク（As）精油が24時間LC50値16.19 ppmであった（表1）。
Ocimum Sainttum (Os EO) を除く、スクリーニングされた他の 4 つの EO はすべて明らかな抗アレルギー効果を示し、24 時間曝露期間における LC50 値は 23.37 ～ 120.16 ppm の範囲でした。Thymophilus striata (Cl) EO は、24 時間曝露後の LC50 値が 23.37 ppm で成虫を殺すのに最も効果的で、次いで Eucalyptus maculata (Em) が 101.91 ppm の LC50 値を示しました (表 1)。一方、Os の LC50 値は、最高用量で 53% という最高死亡率が記録されたため、まだ決定されていません (補足図 3)。
各精油の2つの主要構成化合物は、NISTライブラリデータベースの結果、GCクロマトグラム面積率、およびMSスペクトルの結果に基づいて同定され、選択されました（表2）。精油Asでは、同定された主な化合物はジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドでした。精油Mpでは、同定された主な化合物はカルボンとリモネンでした。精油Emでは、同定された主な化合物はユーデスモールとユーカリプトールでした。精油Osでは、同定された主な化合物はオイゲノールとメチルオイゲノールでした。精油Clでは、同定された主な化合物はオイゲノールとα-ピネンでした（図1、補足図5～8、補足表1～5）。
選択された精油の主要テルペノイドの質量分析結果（A-ジアリルジスルフィド、B-ジアリルトリスルフィド、C-オイゲノール、D-メチルオイゲノール、E-リモネン、F-芳香族セペロン、G-α-ピネン、H-シネオール、R-ユーダモール）。
合計 9 つの化合物 (ジアリルジスルフィド、ジアリルトリスルフィド、オイゲノール、メチルオイゲノール、カルボン、リモネン、ユーカリプトール、ユーデスモール、α-ピネン) が、EO の主要成分である有効化合物として同定され、ネッタイシマカの幼虫段階に対して個別に生物検定された。化合物ユーデスモールは、24 時間曝露後の LC50 値が 2.25 ppm と最も高い殺幼虫活性を示した。化合物ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドも、平均亜致死量が 10〜20 ppm の範囲で潜在的な殺幼虫効果があることがわかった。化合物オイゲノール、リモネン、ユーカリプトールについても、LC50 値が 63.35 ppm、139.29 ppm で中程度の殺幼虫活性が再び観察された。 24 時間後にはそれぞれ 181.33 ppm であった（表 3）。しかし、メチル オイゲノールとカルボンは最高濃度でも有意な殺幼虫効果を示さなかったため、LC50 値は計算されなかった（表 3）。合成殺幼虫剤テメホスは、24 時間曝露後のネッタイシマカに対する平均致死濃度が 0.43 ppm であった（表 3、補足表 6）。
7つの化合物（ジアリルジスルフィド、ジアリルトリスルフィド、ユーカリプトール、α-ピネン、ユーデスモール、リモネン、カルボン）が有効な精油の主要化合物として同定され、成虫のエジプトネッタイシマカに対して個別に試験された。プロビット回帰分析によると、ユーデスモールがLC50値1.82 ppmで最も高い潜在能力を示し、次いでユーカリプトールが24時間曝露でLC50値17.60 ppmを示した。試験された残りの5つの化合物は成虫に対して中程度の有害性を示し、LC50値は140.79～737.01 ppmの範囲であった（表3）。合成有機リン化合物マラチオンはユーデスモールよりも効力が低く、他の6つの化合物よりも効力が高く、24時間曝露期間でLC50値は5.44 ppmであった（表3、補足表6）。
強力なリード化合物7種と有機リン化合物タメホサートを選択し、LC50用量を1:1の比率で混合した二成分混合物を調製した。合計28種類の二成分混合物を調製し、ネッタイシマカに対する殺幼虫効果を試験した。9種類の組み合わせは相乗効果を示し、14種類の組み合わせは拮抗効果を示し、5種類の組み合わせは殺幼虫効果がなかった。相乗効果を示した組み合わせの中で、ジアリルジスルフィドとテモフォールの組み合わせが最も効果的で、24時間後に100%の死亡率が観察された（表4）。同様に、リモネンとジアリルジスルフィド、およびオイゲノールとチメトホスの混合物も良好な可能性を示し、98.3%の幼虫死亡率が観察された（表5）。残りの 4 つの組み合わせ、すなわちユーデスモールとユーカリプトール、ユーデスモールとリモネン、ユーカリプトールと α-ピネン、α-ピネンとテメホスの組み合わせも、90% を超える死亡率が観察され、顕著な殺幼虫効果を示しました。予想される死亡率は 60～75% に近い値です (表 4)。ただし、リモネンと α-ピネンまたはユーカリの組み合わせは拮抗反応を示しました。同様に、テメホスとオイゲノールまたはユーカリ、ユーデスモールまたはジアリルトリスルフィドの混合物は拮抗作用を示すことがわかりました。同様に、ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドの組み合わせ、およびこれらの化合物のいずれかとユーデスモールまたはオイゲノールの組み合わせは、殺幼虫作用において拮抗します。ユーデスモールとオイゲノールまたはα-ピネンの組み合わせでも拮抗作用が報告されている。
成虫の酸性活性について試験した 28 種類の二成分混合物のうち、7 種類が相乗効果を示し、6 種類は効果がなく、15 種類は拮抗効果を示した。ユーデスモールとユーカリ、リモネンとカルボンの混合物は、他の相乗効果を示す混合物よりも効果的であることが判明し、24 時間後の死亡率はそれぞれ 76% と 100% であった (表 5)。マラチオンは、リモネンとジアリルトリスルフィドを除くすべての化合物の組み合わせで相乗効果を示すことが観察されている。一方、ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィド、およびこれらのいずれかとユーカリ、ユーカリプトール、カルボン、またはリモネンとの組み合わせの間には拮抗作用が認められた。同様に、α-ピネンとユーデスモールまたはリモネン、ユーカリプトールとカルボンまたはリモネン、およびリモネンとユーデスモールまたはマラチオンの組み合わせは、拮抗的な殺幼虫効果を示した。残りの6つの組み合わせについては、予想死亡率と観察死亡率に有意差はなかった（表5）。
相乗効果と亜致死量に基づいて、多数のネッタイシマカに対する幼虫殺虫毒性が最終的に選択され、さらに試験された。結果は、オイゲノール-リモネン、ジアリルジスルフィド-リモネン、ジアリルジスルフィド-チメホスの二成分混合物を使用した際の幼虫死亡率が100%であったのに対し、予想される幼虫死亡率はそれぞれ76.48%、72.16%、63.4%であったことを示した（表6）。リモネンとユーデスモールの組み合わせは比較的効果が低く、24時間の曝露期間で88%の幼虫死亡率が観察された（表6）。要約すると、選択された4つの二成分混合物は、大規模に適用した場合、ネッタイシマカに対する相乗的な幼虫殺虫効果も示した（表6）。
成虫のネッタイシマカの大群を制御するための成虫殺虫バイオアッセイには、3 つの相乗効果のある組み合わせが選択されました。大規模な昆虫コロニーでテストする組み合わせを選択するために、まず、最も相乗効果のある 2 つのテルペンの組み合わせ、すなわちカルボンとリモネン、およびユーカリプトールとユーデスモールに注目しました。次に、合成有機リン系殺虫剤マラチオンとテルペノイドの組み合わせから、最も相乗効果のある組み合わせが選択されました。マラチオンとユーデスモールの組み合わせは、観察された死亡率が最も高く、候補成分の LC50 値が非常に低いため、大規模な昆虫コロニーでテストするのに最適な組み合わせであると考えています。マラチオンは、α-ピネン、ジアリルジスルフィド、ユーカリ、カルボン、およびユーデスモールとの組み合わせで相乗効果を示します。しかし、LC50 値を見ると、ユーデスモールが最も低い値 (2.25 ppm) を示します。マラチオン、α-ピネン、ジアリルジスルフィド、ユーカリプトール、カルボンの計算されたLC50値は、それぞれ5.4、716.55、166.02、17.6、140.79 ppmでした。これらの値は、マラチオンとユーデスモールの組み合わせが投与量の観点から最適な組み合わせであることを示しています。結果は、カルボンとリモネン、およびユーデスモールとマラチオンの組み合わせで、予想死亡率が61%から65%であるのに対し、観察死亡率が100%であることを示しました。別の組み合わせであるユーデスモールとユーカリプトールは、24時間の曝露後に死亡率が78.66%であり、予想死亡率が60%であるのに対し、死亡率が高くなりました。選択された3つの組み合わせはすべて、成虫のネッタイシマカに対して大規模に適用した場合でも相乗効果を示しました（表6）。
この研究では、Mp、As、Os、Em、Clなどの選択された植物精油が、ネッタイシマカの幼虫期と成虫期に有望な殺虫効果を示した。Mp精油は、LC50値が0.42 ppmで最も高い殺幼虫活性を示し、次いでAs、Os、Em精油が24時間後に50 ppm未満のLC50値を示した。これらの結果は、蚊や他の双翅目昆虫に関する以前の研究10,11,12,13,14と一致している。Clの殺幼虫効力は、24時間後のLC50値が163.65 ppmと他の精油よりも低いが、成虫に対する効力は24時間後のLC50値が23.37 ppmと最も高い。 Mp、As、Emの精油も、24時間の曝露でLC50値が100～120 ppmの範囲で良好な殺アレルギー効果を示しましたが、殺幼虫効果に比べると相対的に低いものでした。一方、Osの精油は、最高治療用量でも殺アレルギー効果はごくわずかでした。したがって、これらの結果は、植物に対する酸化エチレンの毒性は、蚊の発育段階によって異なる可能性があることを示唆しています15。また、精油の昆虫体内への浸透速度、特定の標的酵素との相互作用、および各発育段階における蚊の解毒能力にも依存します16。多くの研究で、主要成分化合物は全化合物の大部分を占めるため、酸化エチレンの生物活性において重要な因子であることが示されています3,12,17,18。したがって、各精油の2つの主要化合物を考慮しました。 GC-MSの結果に基づくと、ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドがEO Asの主要化合物として同定され、これは以前の報告19,20,21と一致している。以前の報告ではメントールが主要化合物の1つであると示されていたが、カルボンとリモネンが再びMp EOの主要化合物として同定された22,23。Os EOの組成プロファイルは、オイゲノールとメチルオイゲノールが主要化合物であることを示しており、これは以前の研究者の発見と同様である16,24。ユーカリプトールとユーカリプトールはEm葉油に存在する主要化合物として報告されており、これは一部の研究者の発見と一致している25,26が、Olaladeらの発見とは矛盾している27。メラルーカ精油ではシネオールとα-ピネンの優勢が観察され、これは以前の研究と同様である28,29。異なる場所で同じ植物種から抽出された精油の組成と濃度の種内差異が報告されており、本研究でも観察された。これは、地理的な植物の生育条件、収穫時期、発達段階、植物の年齢、化学型の出現などによって影響を受ける。22,30,31,32。次に、特定された主要な化合物を購入し、ネッタイシマカの幼虫に対する効果と成虫に対する効果を試験した。結果は、ジアリルジスルフィドの幼虫に対する活性が粗EO Asのそれと同程度であることを示した。しかし、ジアリルトリスルフィドの活性はEO Asよりも高かった。これらの結果は、Kimbarisら33がCulex philippinesで得た結果と同様である。しかし、これら2つの化合物は、標的蚊に対して良好な自己殺虫活性を示さなかった。これは、Plata-Ruedaら34がTenebrio molitorで得た結果と一致している。 Os EOはネッタイシマカの幼虫期には有効ですが、成虫期には有効ではありません。主要な個々の化合物の殺幼虫活性は粗Os EOのそれよりも低いことが確認されています。これは、粗エチレンオキシド中の他の化合物とその相互作用の役割を示唆しています。メチルオイゲノール単独では活性がほとんどありませんが、オイゲノール単独では中程度の殺幼虫活性があります。この結論は、一方では以前の研究者の結論35,36を裏付け、他方では矛盾しています37,38。オイゲノールとメチルオイゲノールの官能基の違いにより、同じ標的昆虫に対する毒性が異なる可能性があります39。リモネンは中程度の殺幼虫活性があることがわかりましたが、カルボンの効果は有意ではありませんでした。同様に、成虫に対するリモネンの比較的低い毒性とカルボンの高い毒性は、いくつかの以前の研究40の結果を支持しますが、他の研究41とは矛盾します。環内および環外の両方の位置に二重結合が存在すると、これらの化合物の殺幼虫剤としての利点が増加する可能性がある3,41が、不飽和αおよびβ炭素を持つケトンであるカルボンは、成虫に対する毒性の可能性が高くなる可能性がある42。しかし、リモネンとカルボンの個々の特性は、全EO Mpよりもはるかに低い（表1、表3）。試験したテルペノイドの中で、ユーデスモールはLC50値が2.5 ppm未満で最も高い殺幼虫活性と成虫活性を示し、ネッタイシマカの防除に有望な化合物であることが判明した。その性能はEO Em全体よりも優れているが、これはChengら40の知見とは一致しない。ユーデスモールは2つのイソプレン単位を持つセスキテルペンであり、ユーカリなどの酸素化モノテルペンよりも揮発性が低いため、殺虫剤としての可能性が高い。ユーカリプトール自体は、幼虫殺虫活性よりも成虫殺虫活性が高く、以前の研究結果はこれを支持するものと反証するものの両方がある37,43,44。単独の活性は、EO Cl全体の活性とほぼ同等である。別の二環式モノテルペンであるα-ピネンは、成虫に対する効果よりも幼虫殺虫効果が高く、これは完全なEO Clの効果とは逆である。テルペノイドの全体的な殺虫活性は、その親油性、揮発性、炭素分岐、投影面積、表面積、官能基とその位置によって影響を受ける45,46。これらの化合物は、細胞蓄積を破壊したり、呼吸活動を阻害したり、神経インパルスの伝達を遮断したりすることによって作用する可能性がある47。合成有機リン化合物であるテメホスは、LC50値が0.43 ppmで最も高い幼虫殺虫活性を示し、これはLekのデータ-Utala48と一致している。合成有機リン化合物マラチオンの成虫に対する活性は5.44 ppmで報告されている。これら2つの有機リン化合物はネッタイシマカの実験室株に対して良好な反応を示しているが、これらの化合物に対する蚊の抵抗性は世界のさまざまな地域で報告されている49。しかし、ハーブ薬に対する抵抗性の発達に関する同様の報告は見つかっていない50。したがって、植物由来の物質は、ベクター制御プログラムにおける化学農薬の潜在的な代替品と考えられている。
強力なテルペノイドとテルペノイドとチメトホスから調製した28種類の二成分混合物（1:1）について幼虫殺虫効果を試験したところ、9種類の組み合わせが相乗効果、14種類が拮抗効果、5種類が拮抗効果を示し、効果は認められなかった。一方、成虫に対する効力バイオアッセイでは、7種類の組み合わせが相乗効果、15種類の組み合わせが拮抗効果を示し、6種類の組み合わせは効果がないと報告された。特定の組み合わせが相乗効果を生み出す理由は、候補化合物が異なる重要な経路で同時に相互作用すること、または特定の生物学的経路の異なる主要酵素を順次阻害することによる可能性がある51。リモネンとジアリルジスルフィド、ユーカリ、またはオイゲノールの組み合わせは、小規模および大規模な用途の両方で相乗効果があることがわかりました（表 6）。一方、ユーカリまたは α-ピネンとの組み合わせは、幼虫に対して拮抗作用があることがわかりました。平均的に、リモネンはメチル基の存在、角質層への良好な浸透、および異なる作用機序52,53により、優れた相乗剤であると考えられます。リモネンは、昆虫のクチクラに浸透して（接触毒性）、消化器系に影響を与えて（摂食阻害）、または呼吸器系に影響を与えて（燻蒸活性）毒性効果を引き起こす可能性があることが以前に報告されています54。一方、オイゲノールなどのフェニルプロパノイドは代謝酵素に影響を与える可能性があります55。したがって、作用機序の異なる化合物の組み合わせは、混合物の全体的な致死効果を高める可能性があります。ユーカリプトールはジアリルジスルフィド、ユーカリ、またはα-ピネンと相乗効果があることがわかったが、他の化合物との組み合わせでは殺幼虫効果がないか拮抗作用を示した。初期の研究では、ユーカリプトールはアセチルコリンエステラーゼ（AChE）だけでなく、オクタアミン受容体とGABA受容体にも阻害作用があることが示された56。環状モノテルペンであるユーカリプトール、オイゲノールなどは、神経毒性活性と同じ作用機序を持つ可能性があるため57、相互阻害によってそれらの複合効果を最小限に抑えることができる。同様に、テメホスとジアリルジスルフィド、α-ピネン、リモネンの組み合わせは相乗効果があることがわかった。これは、ハーブ製品と合成有機リン化合物との相乗効果に関する以前の報告を裏付けるものである58。
ユーデスモールとユーカリプトールの組み合わせは、ネッタイシマカの幼虫期と成虫期に相乗効果を示すことがわかった。これは、化学構造が異なるため作用機序が異なることが原因と考えられる。ユーデスモール（セスキテルペン）は呼吸器系に影響を与える可能性があり59、ユーカリプトール（モノテルペン）はアセチルコリンエステラーゼに影響を与える可能性がある60。2つ以上の標的部位に成分を同時に曝露すると、組み合わせの全体的な致死効果が高まる可能性がある。成虫物質バイオアッセイでは、マラチオンはカルボンまたはユーカリプトールまたはユーカリプトールまたはジアリルジスルフィドまたはα-ピネンと相乗効果を示すことがわかった。これは、リモネンとジの追加と相乗効果があることを示している。アリルトリスルフィドを除くテルペン化合物の全ポートフォリオに対して、優れた相乗効果のある抗アレルギー剤候補である。 ThangamとKathiresan61も、マラチオンとハーブ抽出物の相乗効果について同様の結果を報告している。この相乗効果は、マラチオンと植物化学物質の昆虫解毒酵素に対する複合的な毒性効果によるものと考えられる。マラチオンなどの有機リン化合物は、一般的にシトクロムP450エステラーゼとモノオキシゲナーゼを阻害することによって作用する62,63,64。したがって、これらの作用機序を持つマラチオンと、異なる作用機序を持つテルペンを組み合わせることで、蚊に対する全体的な致死効果を高めることができる可能性がある。
一方、拮抗作用は、選択された化合物の組み合わせが、各化合物単独の場合よりも活性が低いことを示しています。一部の組み合わせで拮抗作用が生じる理由は、一方の化合物が吸収、分布、代謝、または排泄の速度を変化させることによって、他方の化合物の挙動を変化させるためである可能性があります。初期の研究者は、これが薬物の組み合わせにおける拮抗作用の原因であると考えていました。分子 考えられるメカニズム 65. 同様に、拮抗作用の考えられる原因は、類似した作用機序、構成化合物が同じ受容体または標的部位をめぐる競合に関連している可能性があります。場合によっては、標的タンパク質の非競合阻害も発生する可能性があります。この研究では、2つの有機硫黄化合物、ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドが拮抗作用を示しましたが、これはおそらく同じ標的部位をめぐる競合によるものです。同様に、これら2つの硫黄化合物は拮抗作用を示し、ユーデスモールとα-ピネンと組み合わせると効果がありませんでした。ユーデスモールとα-ピネンは環状であるのに対し、ジアリルジスルフィドとジアリルトリスルフィドは脂肪族である。化学構造に基づくと、これらの化合物の組み合わせは、標的部位が通常異なるため、全体的な致死活性を高めるはずである34,47が、実験的には拮抗作用が見られた。これは、これらの化合物が、相互作用の結果として、いくつかの未知の生物の生体内での役割を果たしているためかもしれない。同様に、シネオールとα-ピネンの組み合わせは拮抗反応を引き起こしたが、研究者らは以前、これら2つの化合物は異なる作用標的を持っていると報告している47,60。両方の化合物は環状モノテルペンであるため、結合をめぐって競合し、研究された組み合わせペアの全体的な毒性に影響を与える可能性のある共通の標的部位が存在する可能性がある。
LC50値と観察された死亡率に基づいて、最も相乗効果の高いテルペンの組み合わせとして、カルボン＋リモネンとユーカリプトール＋ユーデスモールの組み合わせ、およびテルペンと合成有機リン化合物マラチオンが選ばれた。マラチオン＋ユーデスモール化合物の最適な相乗効果の組み合わせは、成虫殺虫剤バイオアッセイでテストされた。これらの効果的な組み合わせが、比較的広い暴露空間で多数の個体に対して機能するかどうかを確認するために、大きな昆虫コロニーをターゲットにした。これらの組み合わせはすべて、昆虫の大群に対して相乗効果を示した。ネッタイシマカの幼虫の大集団に対してテストされた最適な相乗効果のある幼虫駆除剤の組み合わせについても同様の結果が得られた。したがって、植物精油化合物の効果的な相乗的な殺幼虫・殺成虫作用の組み合わせは、既存の合成化学物質に対抗する有力な候補であり、ネッタイシマカの個体群制御にさらに活用できると言える。同様に、合成殺幼虫剤または殺成虫剤とテルペンの効果的な組み合わせは、蚊に投与されるチメトホスやマラチオンの投与量を減らすためにも利用できる。これらの強力な相乗効果の組み合わせは、ネッタイシマカにおける薬剤耐性の進化に関する今後の研究に解決策を提供する可能性がある。
ネッタイシマカの卵は、インド医学研究評議会ディブルガル地域医学研究センターから採取され、以下の条件でグワハティ大学動物学科で温度（28 ± 1 °C）と湿度（85 ± 5%）が制御された状態で保管された。アリボリはet al.によって記載された。孵化後、幼虫には幼虫用飼料（ドッグビスケット粉末と酵母を3：1の割合で混合したもの）を与え、成虫には10%グルコース溶液を与えた。羽化後3日目から、成虫の雌蚊にアルビノラットの血液を吸わせた。ろ紙をガラス容器の水に浸し、産卵ケージに入れる。
ユーカリの葉（フトモモ科）、ホーリーバジル（シソ科）、ミント（シソ科）、メラレウカ（フトモモ科）、アリウムの球根（ヒガンバナ科）などの植物サンプルを選定した。これらのサンプルはグワハティで採取され、グワハティ大学植物学科によって同定された。採取した植物サンプル（500g）をクレベンジャー装置を用いて6時間水蒸気蒸留した。抽出された精油は清潔なガラスバイアルに集め、4℃で保存してさらに研究を行った。
殺幼虫毒性は、世界保健機関の標準手順を若干変更して研究した 67 。乳化剤として DMSO を使用する。各 EO 濃度は、最初に 100 ppm と 1000 ppm でテストし、各反復で 20 匹の幼虫を曝露した。結果に基づいて濃度範囲を適用し、処理後 1 時間から 6 時間 (1 時間間隔)、および 24 時間、48 時間、72 時間後の死亡率を記録した。亜致死濃度 (LC50) は、24 時間、48 時間、72 時間の曝露後に決定した。各濃度は、1 つの陰性対照 (水のみ) と 1 つの陽性対照 (DMSO 処理水) とともに 3 回ずつ試験した。蛹化が起こり、対照群の幼虫の 10% 以上が死亡した場合は、実験を繰り返す。対照群の死亡率が 5〜10% の場合は、アボット補正式 68 を使用する。
Ramar ら 69 が説明した方法は、アセトンを溶媒として用いたネッタイシマカ成虫に対するバイオアッセイに使用された。各精油は、まず 100 ppm および 1000 ppm の濃度でネッタイシマカ成虫に対して試験された。調製した各溶液 2 ml を Whatman 番号 1 のろ紙 (サイズ 12 x 15 cm2) に塗布し、アセトンを 10 分間蒸発させる。アセトン 2 ml のみで処理したろ紙をコントロールとして使用した。アセトンが蒸発した後、処理したろ紙とコントロールろ紙を円筒形のチューブ (深さ 10 cm) に入れる。3 ～ 4 日齢の非吸血蚊 10 匹を各濃度の 3 連に移した。予備試験の結果に基づいて、選択した精油のさまざまな濃度を試験した。蚊の放飼後、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、24時間、48時間、72時間後に死亡率を記録した。24時間、48時間、72時間の曝露時間におけるLC50値を計算する。対照群の死亡率が20%を超える場合は、試験全体を繰り返す。同様に、対照群の死亡率が5%を超える場合は、アボットの式68を使用して処理サンプルの結果を調整する。
選択した精油の構成成分を分析するために、ガスクロマトグラフィー（Agilent 7890A）と質量分析法（Accu TOF GCv、日本電子製）を実施した。GCにはFID検出器とキャピラリーカラム（HP5-MS）が装備されていた。キャリアガスはヘリウムで、流量は1 ml/分であった。 GC プログラムでは、Allium sativum を 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M、Ocimum Sainttum を 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280、ミントを 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280、ユーカリを 20.60-1M-10-200-3M-30-280、レッド For a thousand layers を 10: 60-1M-8-220-5M-8-270-3M に設定しています。
各精油の主要成分は、GCクロマトグラムおよび質量分析の結果から算出された面積百分率に基づいて同定された（NIST 70標準データベースを参照）。
各精油に含まれる主要な2つの化合物は、GC-MS分析結果に基づいて選定され、さらなる生物学的アッセイのために、純度98～99%のものをSigma-Aldrich社から購入した。これらの化合物は、上記のようにネッタイシマカの幼虫および成虫に対する殺虫効果について試験された。最も一般的に使用されている合成幼虫駆除剤であるタメホサート（Sigma Aldrich社製）と成虫駆除剤であるマラチオン（Sigma Aldrich社製）についても、同じ手順に従って、選定された精油化合物との有効性を比較分析した。
選択されたテルペン化合物とテルペン化合物＋市販の有機リン化合物（チレホスとマラチオン）の二成分混合物を、各候補化合物のLC50用量を1：1の比率で混合して調製した。調製した混合物を、上記のようにネッタイシマカの幼虫期と成虫期で試験した。各生物検定は、各混合物について3回、各混合物に含まれる個々の化合物について3回実施した。対象昆虫の死亡は24時間後に記録した。次の式を使用して、二成分混合物の予想死亡率を計算する。
ここで、E = 二項結合、すなわち接続 (A + B) に対するネッタイシマカの予想死亡率。
各二成分混合物の効果は、Pavla52によって記述された方法で計算されたχ2値に基づいて、相乗効果、拮抗効果、または効果なしとして分類されました。次の式を使用して、各組み合わせのχ2値を計算します。
組み合わせの効果は、計算されたχ2値が対応する自由度（95%信頼区間）の表の値よりも大きく、かつ観察された死亡率が予想死亡率を上回った場合に相乗的であると定義した。同様に、いずれかの組み合わせについて計算されたχ2値がいくつかの自由度で表の値を超えているにもかかわらず、観察された死亡率が予想死亡率よりも低い場合、その治療は拮抗的であるとみなした。また、いずれの組み合わせにおいても、計算されたχ2値が対応する自由度の表の値よりも小さい場合、その組み合わせは効果がないものとみなした。
相乗効果が期待できる組み合わせ（幼虫100匹、成虫50匹）を多数匹の昆虫に対して試験するために選択した。成虫に対する殺虫活性試験は上記と同様に行った。混合物に加えて、選択した混合物に含まれる個々の化合物も、同数のネッタイシマカの幼虫と成虫に対して試験した。組み合わせの比率は、1つの候補化合物のLC50用量と、もう1つの構成化合物のLC50用量の比率である。成虫に対する殺虫活性バイオアッセイでは、選択した化合物を溶媒アセトンに溶解し、1300 cm3の円筒形プラスチック容器に包んだろ紙に塗布した。アセトンを10分間蒸発させ、成虫を放した。同様に、殺幼虫バイオアッセイでは、まずLC50候補化合物を等量のDMSOに溶解し、次に1300 ccのプラスチック容器に保存した1リットルの水と混合し、幼虫を放した。
記録された71件の死亡データについて、SPSS（バージョン16）およびMinitabソフトウェアを使用して確率分析を行い、LC50値を算出した。
投稿日時：2024年7月1日
