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天然産物の発見と有益な利用は、人間の生活を改善するのに役立ちます。植物成長阻害化学物質は、雑草を防除するための除草剤として広く使用されています。さまざまな種類の除草剤を使用する必要があるため、新しい作用機序を持つ化合物を特定する必要があります。本研究では、Streptomyces werrensis MK493-CF1 から新規 N -アルコキシピロール化合物クマモンアミドを発見し、完全な合成プロセスを確立しました。生物学的活性アッセイを通じて、我々はウルス-モノアミド酸がウルス-モノアミドの合成中間体であり、潜在的な可能性があることを発見しました。植物成長阻害剤。さらに、HeLa細胞の増殖に悪影響を及ぼさずに高い除草活性を有するウルベニルオキシ誘導体（UDA）をはじめとする各種ウルベン酸誘導体を開発しました。また、ウルモン酸誘導体が植物の微小管を破壊することも発見しました。さらに、KAND はアクチンフィラメントに影響を与え、細胞死を誘導します。これらの多面的な効果は、既知の微小管阻害剤の効果とは異なり、ウルソン酸の新しい作用機序を示唆しており、これは新しい除草剤の開発において重要な利点となる。
有益な天然物とその誘導体の発見と実用化は、人間の生活の質を向上させる手段です。微生物、植物、昆虫によって生成される二次代謝産物は、医学と農業に大きな進歩をもたらしました。多くの抗生物質や抗白血病薬は天然物から開発されています。このほかにも、さまざまな種類の殺虫剤、殺菌剤や除草剤は、農業で使用するためにこれらの天然産物から抽出されます。特に雑草防除除草剤は現代農業において作物の収量を増加させるための重要な手段であり、既に様々な種類の化合物が商業的に使用されている。光合成、アミノ酸代謝、細胞壁合成、有糸分裂の調節、植物ホルモンシグナル伝達、タンパク質合成などの植物のいくつかの細胞プロセスは、除草剤の典型的な標的と考えられています。微小管の機能を阻害する化合物は、有糸分裂制御に影響を与えて植物の成長に影響を与える一般的な種類の除草剤です2。
微小管は細胞骨格の構成要素であり、真核細胞に広く保存されています。チューブリンヘテロ二量体は、線状微小管プロトフィラメントを形成するαチューブリンとβチューブリンから構成され、13本のプロトフィラメントが円筒構造を形成します。微小管は、細胞の形状、細胞分裂、細胞内輸送の決定など、植物細胞において複数の役割を果たします 3,4。植物細胞には間期細胞膜の下に微小管が含まれており、これらのいわゆる皮質微小管は、セルロースシンターゼ複合体の制御を通じてセルロースミクロフィブリルの組織化を制御すると考えられています4,5。根の先端の急速な伸長領域に存在する根の表皮細胞の皮質微小管は側方に位置しており、セルロースマイクロファイバーがこれらの微小管に追従して細胞の伸長方向を制限することで、異方性の細胞伸長を促進します。したがって、微小管の機能は植物の形態と密接に関係しています。チューブリンをコードする遺伝子のアミノ酸置換は、シロイヌナズナにおいて皮質微小管配列の歪みと左側または右側の成長を引き起こします 6,7。同様に、微小管の動態を調節する微小管関連タンパク質の変異も、根の成長の歪みを引き起こす可能性があります8、9、10、11、12、13。さらに、プレチラクロールとしても知られるジソピラミドなどの微小管破壊除草剤による処理も、左側斜めの根の成長を引き起こします14。これらのデータは、微小管機能の正確な制御が植物の成長の方向を決定するために重要であることを示しています。
さまざまな種類の微小管阻害剤が発見されており、これらの薬剤は細胞骨格の研究、農業、医学に大きく貢献しています2。特に、オリザリン、ジニトロアニリン化合物、ジソピラミド、ベンズアミド関連化合物、およびそれらの類似体は、微小管の機能を阻害し、それによって植物の成長を阻害する可能性があります。したがって、それらは除草剤として広く使用されています。しかし、微小管は植物細胞と動物細胞の重要な構成要素であるため、ほとんどの微小管阻害剤は両方の細胞タイプに対して細胞毒性があります。したがって、除草剤としての有用性が認められているにもかかわらず、実用的な目的で使用されている抗微小管剤の数は限られている。
Streptomyces は、好気性、グラム陽性、糸状菌を含む Streptomyces 科の属で、広範囲の二次代謝産物を生成する能力で広く知られています。したがって、新しい生物学的に活性な天然物の最も重要な供給源の 1 つと考えられています。今回の研究では、Streptomyces werraensis MK493-CF1 および S. werraensis ISP 5486 から単離されたクマモナミドと呼ばれる新しい化合物を発見しました。スペクトル分析とフルスペクトル分析を使用して、クマモナミドの構造とその固有の N-アルコキシピロール骨格を特徴付けました。決定されました。合成。ウルスモノアミドとその誘導体の合成中間体であるウルスモン酸が、人気のモデル植物であるシロイヌナズナの成長と発芽を阻害することが判明した。構造活性相関研究において、我々は、ウルソン酸のノニルオキシ誘導体（KAND）と呼ばれるウルソン酸に修飾されたC9を持つ化合物が、成長と発芽に対する阻害効果を顕著に増強することを発見しました。注目すべきことに、新たに発見された植物成長阻害剤はタバコやゼニゴケの成長にも影響を及ぼし、細菌やHeLa細胞に対して細胞毒性がなかった。さらに、一部のウルモトン酸誘導体は歪んだ根の表現型を誘導し、これらの誘導体が直接的または間接的に微小管に影響を与えることを示唆しています。この考えと一致して、免疫組織化学的にまたは蛍光タンパク質で標識された微小管の我々の観察は、KAND処理が微小管を解重合することを示している。さらに、クマモトン酸誘導体による処理はアクチンマイクロフィラメントを破壊しました。このようにして、我々は、細胞骨格の破壊を含む独特の作用機序をもつ新しい植物成長阻害剤を発見した。
MK493-CF1株は、東京都品川区の土壌から分離されました。MK493-CF1 株は、よく分岐した間質菌糸体を形成しました。16SリボソームRNA遺伝子(1422bp)の部分配列を決定した。この株は S. weraensis に非常によく似ています (NBRC 13404T = ISP 5486、1421/1422 bp、T: 典型的な株、99.93%)。この結果から、本菌株は S. weraensis の基準菌株と近縁であることが判明した。したがって、この株を仮に S. weraensis MK493-CF1 と命名しました。S. werrensis ISP 5486T も同じ生理活性化合物を生成します。この微生物から天然物を得る初期の研究はほとんどなかったため、さらなる化学研究が行われました。３０℃で１４日間固体発酵によりオオムギ培地上でＳ．ｗｅｒｒａｅｎｓｉｓ ＭＫ４９３－ＣＦ１を培養した後、培地を５０％ＥｔＯＨで抽出した。６０ｍｌのサンプルを乾燥させて、５９．５ｍｇの粗抽出物を得た。粗抽出物を逆相ＨＰＬＣに付して、Ｎ－メトキシ－１Ｈ－ピロール－２－カルボキサミド（１、クマモナミドと命名、３６．０ｍｇ）を得た。1 の合計量は粗抽出物の約 60% です。そこで、クマモトアミド 1 の性質を詳しく調べることにしました。
クマモナミド 1 は白色の非晶質粉末であり、高分解能質量分析 (HRESIMS) により C6H8N2O2 が確認されます (図 1)。この化合物の C2 置換ピロール フラグメントは、δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4)、δH 6.78 (1H, d, J = 2.5、1H NMR スペクトルのδH: 4.5 Hz) によって特徴付けられます。 、H-5) およびδH 6.78 (1H、d、J = 2.5 Hz、H-6)、および 13 C NMR スペクトルは 4 つの sp2 炭素原子の存在を示します。Ｃ２位のアミド基の存在は、Ｃ－３プロトンからδＣ１６１．１のアミドカルボニル炭素までのＨＭＢＣ相関によって評価した。さらに、δＨ ４．１０（３Ｈ、Ｓ）およびδＣ ６８．３における １ Ｈおよび １３ Ｃ ＮＭＲピークは、分子内にＮ－メトキシ基が存在することを示している。メトキシ基の正確な位置は、増強差分光法や核オーバーハウザー略語 (NOEDF) などの分光分析ではまだ決定されていませんでしたが、N-メトキシ-1H-ピロール-2-カルボキサミドが最初の候補化合物となりました。
1 の正しい構造を決定するために、全合成が実行されました (図 2a)。市販の 2-アミノピリジン 2 を m-CPBA で処理すると、対応する N-オキシド 3 が定量的収率で得られます。2 の 2-アミノアジド化の後、Abramovich によって記載された環化縮合反応をベンゼン中 90℃で実施して、所望の 1-ヒドロキシ-1H-ピロール-2-カルボニトリル 5 をグラムで得ました。速度60％（2段階）。15、16。次いで、４のメチル化および加水分解により、１－メトキシ－１Ｈ－ピロール－２－カルボン酸（「クモトン酸」と呼ばれる、６）が良好な収率（７０％、２段階）で得られた。最後に、アンモニア水を使用した酸塩化物中間体 6 によるアミド化により、熊本アミド 1 が 98% の収率で得られました。合成された 1 のすべてのスペクトル データは、単離された 1 と類似していたので、1 の構造が決定されました。
ウルベナミドおよびウルベン酸の生物学的活性の一般的な合成と分析。(a) クマモトアミドの全合成。（b）生後7日目の野生型シロイヌナズナ（Col）実生を、示された濃度のクマモナミド6またはクマモナミド1を含むMurashige and Skoog（MS）プレート上で生育させた。スケールバー = 1 cm。
まず、ウルベナミドとその中間体の生物活性を、植物の成長を調節する能力について評価しました。MS寒天培地にウルスモンアミド1またはウルスモン酸6を様々な濃度で添加し、この培地上でシロイヌナズナ実生を培養しました。これらのアッセイは、高濃度（500μM）の6が根の成長を阻害することを示しました（図2b）。次に、6 の N1 位を置換することによりさまざまな誘導体を生成し、それらの構造活性相関研究を実行しました (アナログ合成プロセスはサポート情報 (SI) に記載されています)。シロイヌナズナの苗を50μMのウルソン酸誘導体を含む培地上で生育させ、根の長さを測定した。写真に示されているように。図 3a、b、および S1 に示すように、クマモ酸は、N1 位に異なる長さの直鎖アルコキシ鎖 (9、10、11、12、および 13) または大きなアルコキシ鎖 (15、16、および 17) を持っています。誘導体は根の成長を顕著に阻害した。さらに、200μMの10、11、または17の適用が発芽を阻害することを発見しました（図3cおよびS2）。
クマモトアミドおよび関連化合物の構造活性相関の研究。(a) 類似体の構造と合成スキーム。(b) 50 μM クマモンアミド誘導体を含むまたは含まない MS 培地上で生育した 7 日齢の苗の根の長さの定量化。アスタリスクは、偽治療との有意差を示します (t 検定、p< 0.05)。n>18. データは平均値 ± SD として表示されます。nt は、50% 以上の種子が発芽しなかったため、「テストされていない」ことを意味します。(c) 200 μM クマモナミドおよび関連化合物を含むまたは含まない MS 培地中で 7 日間インキュベートした処理種子の発芽率の定量化。アスタリスクは、偽治療 (カイ二乗検定) との有意な差を示します。n=96。
興味深いことに、C9より長いアルキル側鎖を付加すると阻害活性が低下したことから、熊本酸関連化合物が生物活性を発揮するにはある程度の大きさの側鎖が必要であることが示唆された。
構造活性相関解析により、C9がウルソン酸に修飾され、ウルソン酸のノニルオキシ誘導体（以下、KAND 11）が最も効果的な植物成長阻害剤であることが示されたため、KAND 11のより詳細な特性評価を実施しました。 シロイヌナズナの治療50μMのKAND 11では発芽がほぼ完全に妨げられましたが、より低い濃度（40、30、20、または10μM）のKAND 11では用量依存的に根の成長が阻害されました（図4a、b）。KAND 11 が根分裂組織の生存率に影響を与えるかどうかをテストするために、ヨウ化プロピジウム (PI) で染色した根分裂組織を検査し、分裂組織の領域サイズを測定しました。25μM KAND-11を含む培地で生育した実生の分裂組織のサイズは151.1±32.5μmでしたが、DMSOを含む対照培地で生育した実生の分裂組織のサイズは264.7±30.8μmでした（図4c、d）。これは、KAND-11 が細胞活動を回復することを示しています。広がる。根分裂組織。これと一致して、KAND 11 処理は根分裂組織における細胞分裂マーカー CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS シグナルの量を減少させました (図 4e) 17 。これらの結果は、KAND 11 が細胞増殖活性を低下させることにより根の成長を阻害することを示しています。
ウルベン酸誘導体（ウルベニルオキシ誘導体）の増殖抑制効果の解析。(a) 示された濃度の KAND 11 を含む MS プレート上で生育した生後 7 日の野生型 Col 実生。スケール バー = 1 cm。(b) 根の長さの定量化。文字は有意差を示します (Tukey HSD テスト、p< 0.05)。n>16. データは平均値 ± SD として表示されます。（c）25μM KAND 11の存在下または非存在下でMSプレート上で増殖させた、ヨウ化プロピジウムで染色した野生型Col根の共焦点顕微鏡検査。白い括弧は根の分裂組織を示します。スケールバー = 100 μm。(d) 根分裂組織サイズの定量化 (n = 10 ～ 11)。統計的差異は、t 検定 (p< 0.05)。バーは平均分裂組織サイズを表します。（ e ）CDKB2構築物を含む根分裂組織の微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡検査。1pro: CDKB2;1-GUS は、25 μM KAND アッセイの有無にかかわらず、MS プレート上で生育した 5 日齢の実生を染色および染色しました。
KAND 11 の薬毒性は、別の双子葉植物であるタバコ (Nicotiana tabacum) と主要な陸上植物モデル生物であるゼニゴケ (Marchantia Polymorpha) を使用してさらに試験されました。シロイヌナズナの場合と同様に、25μM KAND 11を含む培地上で生育したタバコSR-1実生は、より短い根を生成した(図5a)。さらに、200 μM KAND 11 を含むプレートでは 48 個の種子のうち 40 個が発芽しましたが、模擬処理した培地では 48 個の種子すべてが発芽しました。これは、高濃度の KAND が有意であることを示しています (p< 0.05;カイ テスト -square) はタバコの発芽を阻害しました。(図5b)。さらに、ゼニゴケにおける細菌の増殖を阻害したKAND 11の濃度は、シロイヌナズナにおける有効濃度と同様でした（図5c）。これらの結果は、KAND 11 がさまざまな植物の成長を阻害できることを示しています。次に、他の生物、つまり高等動物細胞と細菌細胞の代表として、それぞれヒト HeLa 細胞と大腸菌 DH5α 株におけるクマモノアミド関連化合物の細胞毒性の可能性を調査しました。一連の細胞増殖アッセイでは、クマモナミド 1、クマモナミド酸 6、および KAND 11 が 100 μM の濃度で HeLa 細胞または大腸菌細胞の増殖に影響を及ぼさないことが観察されました（図 5d、e）。
非シロイヌナズナ生物における KAND 11 の増殖阻害。(a) 生後 2 週間の野生型 SR-1 タバコ苗を、25 μM KAND 11 を含む垂直に配置した MS プレート上で生育させました。(b) 生後 2 週間の野生型 SR-1 タバコの苗を水平に配置した MS プレート上で生育させました。 200 μM KAND 11を含むMSプレート。(c) 表示濃度のKAND 11を含むGamborg B5プレート上で増殖させた生後2週間の野生型Tak-1ゼニゴケの芽。赤い矢印は、2週間のインキュベーション以内に増殖が停止した胞子を示す。期間。(d) HeLa 細胞の細胞増殖アッセイ。生細胞数はセルカウンティングキット８（同仁堂）を用いて一定時間ごとに測定した。対照として、HeLa 細胞を 5 μg/ml のアクチノマイシン D (Act D) で処理しました。これは RNA ポリメラーゼの転写を阻害し、細胞死を引き起こします。分析は３回実施した。(e) 大腸菌細胞増殖アッセイ。大腸菌の増殖は、OD600を測定することによって分析されました。対照として、細胞を細菌の細胞壁合成を阻害する50μg/mlアンピシリン(Amp)で処理した。分析は３回実施した。
ウラミド関連化合物による細胞毒性の作用機序を解明するために、我々は中程度の阻害作用を持つウルベン酸誘導体を再解析した。写真に示されているように。図 2b、6a に示すように、高濃度 (200 μM) のウルモン酸 6 を含む寒天プレート上で生育した苗木は、より短く左に湾曲した根 (θ = – 23.7 ± 6.1) を生成しましたが、対照培地で生育した苗木では、苗木はほぼ真っ直ぐな根を生成しました (θ = – 3.8 ± 7.1)。この特徴的な斜めの成長は、皮質微小管の機能不全に起因することが知られています 14,18。この発見と一致して、微小管を不安定にする薬剤のジソピラミドとオリザリンは、我々の生育条件下で同様の根の傾斜を誘発しました（図2b、6a）。同時に、ウルモトン酸誘導体をテストし、特定の濃度で斜めの根の成長を誘導するいくつかの誘導体を選択しました。化合物8、9、および15は、それぞれ75μM、50μM、および40μMで根の成長方向を変化させ、これらの化合物が微小管を効果的に不安定化できることを示した（図2b、6a）。また、最も強力なウルソール酸誘導体である KAND 11 を低濃度 (15 μM) でテストしたところ、KAND 11 の適用により根の成長が阻害され、根の成長方向は左に傾く傾向があるものの、不均一であることがわかりました (図C3)。。高濃度の微小管不安定化薬剤は根の傾きを引き起こすのではなく、植物の成長を阻害する場合があるため、我々はその後、根の表皮細胞の皮質微小管を観察することによって、KAND 11 が微小管に影響を与える可能性を評価しました。25μM KAND 11で処理した苗の根の表皮細胞における抗βチューブリン抗体を用いた免疫組織化学により、伸長ゾーンの表皮細胞のほぼすべての皮質微小管の消失が示されました（図6b）。これらの結果は、クマモトン酸およびその誘導体が微小管に直接または間接的に作用して微小管を破壊すること、およびこれらの化合物が新規な微小管阻害剤であることを示しています。
ウルソン酸とその誘導体は、シロイヌナズナの皮質微小管を変化させます。(a) 示された濃度のさまざまなウルモン酸誘導体の存在下で測定された根の傾斜角。微小管を阻害することが知られている 2 つの化合物、ジソピラミドとオリザリンの効果も分析されました。挿入図は、根の成長角度を測定するために使用される基準を示しています。アスタリスクは、偽治療との有意差を示します (t 検定、p< 0.05)。n>19. スケールバー = 1 cm。(b) 伸長ゾーンの表皮細胞の皮質微小管。25μM KAND 11の存在下または非存在下でMSプレート上で生育した野生型シロイヌナズナ Col 根の微小管を、β-チューブリン一次抗体およびAlexa Fluor結合二次抗体を使用した免疫組織化学染色によって視覚化しました。スケールバー = 10 μm。(c) 根分裂組織における微小管の有糸分裂構造。微小管は免疫組織化学的染色を使用して視覚化されました。前期ゾーン、紡錘体、隔膜形成体などの有糸分裂構造を共焦点画像から数えました。矢印は有糸分裂微小管構造を示します。アスタリスクは、偽治療との有意差を示します (t 検定、p< 0.05)。n>9. スケールバー = 50 μm。
Ursa は微小管の機能を破壊する能力を持っていますが、その作用機序は一般的な微小管解重合剤とは異なることが予想されます。例えば、ジソピラミドやオリザリンなどの高濃度の微小管脱重合剤は表皮細胞の異方性増殖を誘導しますが、KAND 11 は誘導しません。さらに、KAND 11 とジソピラミドを併用すると、ジソピラミド誘導性の根の成長反応が複合的に起こり、KAND 11 誘導性の成長阻害が観察されました (図 S4)。また、KAND 11 に対する過敏性ジソピラミド 1-1 (phs1-1) 変異体の応答も分析しました。phs1-1 には非標準的なチューブリンキナーゼ点変異があり、ジソピラミドで処理すると根が短くなります 9,20。KAND 11を含む寒天培地上で生育したphs1-1変異体実生は、ジソピラミッド上で生育したものと同様に短い根を持っていました（図S5）。
さらに、KAND 11 で処理した実生の根分裂組織において、前期ゾーン、紡錘体、隔膜形成体などの有糸分裂微小管構造を観察しました。CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS の観察と一致して、有糸分裂微小管の数が観察されました (図 6c)。
KAND 11 の細胞毒性を細胞内分解能で特徴付けるために、タバコ BY-2 浮遊細胞を KAND 11 で処理し、その応答を観察しました。まず、微小管を蛍光標識するTagRFP-TUA6を発現するBY-2細胞にKAND 11を添加し、皮質微小管に対するKAND 11の効果を評価した。皮質微小管密度は、細胞質ピクセル中の細胞骨格ピクセルの割合を定量化する画像分析を使用して評価されました。アッセイ結果は、50 μM または 100 μM KAND 11 で 1 時間処理した後、密度がそれぞれ 0.94 ± 0.74% または 0.23 ± 0.28% に大幅に減少する一方、DMSO で処理された細胞の密度は 1.61 ± 0.34 に達したことを示しました。 ％（図７ａ）。これらの結果は、KAND 11処理が皮質微小管の解重合を誘導するというシロイヌナズナの観察と一致しています（図6b）。また、同じ濃度のKAND 11で処理した後のGFP-ABD標識アクチンフィラメントを有するBY-2株を調べ、KAND 11処理がアクチンフィラメントを破壊することを観察した。50μMまたは100μMのKAND 11で1時間処理すると、アクチンフィラメント密度がそれぞれ1.20±0.62％または0.61±0.26％に大幅に減少しましたが、DMSO処理細胞の密度は1.69±0.51％でした（図2）。7b)。これらの結果は、アクチンフィラメントに影響を与えないプロピザミドや、微小管に影響を与えないアクチン解重合剤であるラトランキュリンBの効果とは対照的です（SI図S6）。さらに、クマモナミド 1、クマモナミド酸 6、または KAND 11 による処理は、HeLa 細胞の微小管に影響を与えませんでした (SI、図 S7)。したがって、KAND 11 の作用機序は、既知の細胞骨格破壊物質の作用機序とは異なると考えられています。さらに、KAND 11 で処理した BY-2 細胞の顕微鏡観察により、KAND 11 処理中の細胞死の開始が明らかになり、エバンス ブルーで染色された死細胞の割合は KAND 11 処理の 30 分後に有意には増加しなかったが、 50μMまたは100μMのKANDで90分間処理した後、死細胞の数はそれぞれ43.7%または80.1%に増加しました(図7c)。総合すると、これらのデータは、新規ウルソール酸誘導体 KAND 11 が、これまで知られていなかった作用機序を持つ植物特異的な細胞骨格阻害剤であることを示しています。
KAND は、皮質微小管、アクチンフィラメント、およびタバコ BY-2 細胞の生存率に影響を与えます。(a) TagRFP-TUA6 の存在下での BY-2 細胞の皮質微小管の視覚化。KAND 11 (50 μM または 100 μM) または DMSO で処理した BY-2 細胞を共焦点顕微鏡で検査しました。皮質微小管密度は、25 個の独立した細胞の顕微鏡写真から計算されました。文字は有意差を示します (Tukey HSD テスト、p< 0.05)。スケールバー = 10 μm。(b) GFP-ABD2 の存在下で可視化された BY-2 細胞の皮質アクチンフィラメント。KAND 11 (50 μM または 100 μM) または DMSO で処理した BY-2 細胞を共焦点顕微鏡で検査しました。皮質アクチンフィラメントの密度は、25 個の独立した細胞の顕微鏡写真から計算されました。文字は有意差を示します (Tukey HSD テスト、p< 0.05)。スケールバー = 10 μm。(c) エバンスブルー染色による死滅したBY-2細胞の観察。KAND 11 (50 μM または 100 μM) または DMSO で処理した BY-2 細胞を明視野顕微鏡で検査しました。n=3。スケールバー = 100 μm。
新しい天然産物の発見と応用は、医学や農業を含む人間の生活のさまざまな側面に大きな進歩をもたらしました。天然資源から有用な化合物を得るために歴史的研究が行われてきました。特に、放線菌は、抗がん剤として医薬的に使用されるイベルメクチンおよびブレオマイシンのリード化合物であるアベルメクチンおよびその誘導体などのさまざまな二次代謝産物を生成する能力により、線虫の抗寄生虫抗生物質として有用であることが知られている21,22。同様に、さまざまな除草性化合物が放線菌から発見されており、その一部はすでに商業的に使用されています 1,23。したがって、放線菌の代謝産物を分析して、望ましい生物学的活性を持つ天然産物を単離することは効果的な戦略であると考えられます。本研究では、S. weraensis から新規化合物であるクマモナミドを発見し、合成に成功しました。ウルソン酸は、ウルベナミドおよびその誘導体の合成中間体です。特徴的な根のカールを引き起こし、中程度から強力な除草活性を示し、植物の微小管に直接的または間接的に損傷を与える可能性があります。しかし、KAND 11 もアクチンフィラメントを破壊して細胞死を引き起こすため、ウルモン酸の作用機序は既存の微小管阻害剤とは異なる可能性があり、ウルモン酸とその誘導体が広範囲の細胞骨格構造に影響を与える調節機構を示唆している。。
ウルベン酸のさらに詳細な特性評価は、ウルベン酸の作用機序をよりよく理解するのに役立ちます。特に、次の目標は、ウルソン酸が還元された微小管に結合する能力を評価し、ウルソン酸とその誘導体が微小管に直接作用して解重合するのか、それともその作用が微小管の不安定化を引き起こすのかを判定することである。さらに、微小管が直接の標的ではない場合、植物細胞に対するウルソン酸の作用部位と分子標的を特定することは、関連化合物の特性と除草活性を向上させる可能な方法をさらに理解するのに役立ちます。私たちの生物活性アッセイにより、シロイヌナズナ、タバコ、ゼニゴケなどの植物の成長に対するウルソン酸の独特の細胞毒性能力が明らかになりましたが、大腸菌も HeLa 細胞も影響を受けませんでした。ウルソン酸誘導体が野外農地で使用する除草剤として開発された場合、動物細胞に対する毒性がほとんどまたはまったくないという利点があります。実際、微小管は真核生物に共通の構造であるため、植物における微小管の選択的阻害は除草剤の重要な要件です。例えば、チューブリンに直接結合して重合を阻害する微小管解重合剤であるプロピザミドは、動物細胞に対する毒性が低いため、除草剤として使用されています24。ジソピラミドとは対照的に、関連するベンズアミドは異なる標的特異性を持っています。植物の微小管に加えて、RH-4032 またはベンゾキサミドはそれぞれ動物細胞または卵菌の微小管も阻害し、ザリラミドは植物毒性が低いため殺菌剤として使用されます 25,26,27。新たに発見されたクマとその誘導体は植物に対して選択的な細胞毒性を示すが、さらなる修飾により標的特異性が変化し、病原性真菌や卵菌を制御するための追加の誘導体が提供される可能性があることは注目に値する。
ウルベン酸とその誘導体の独特の特性は、除草剤としての開発や研究ツールとしての使用に役立ちます。植物細胞の形状の制御における細胞骨格の重要性は広く認識されています。これまでの研究では、植物が微小管の動態を制御して形態形成を適切に制御することにより、皮質微小管組織化の複雑な機構を進化させてきたことが示されている。微小管活性の制御に関与する分子が多数同定されており、関連する研究が現在も進行中です 3,4,28。植物細胞における微小管の動態に関する現在の理解では、皮質微小管の組織化のメカニズムを完全には説明できません。例えば、ジソピラミドとオリザリンは両方とも微小管を解重合することができますが、ジソピラミドは深刻な根の歪みを引き起こしますが、オリザリンの効果は比較的穏やかです。さらに、微小管を安定化するチューブリンの変異も根の右旋性を引き起こしますが、同じく微小管の動態を安定化するパクリタキセルは右旋性を引き起こしません。したがって、ウルソール酸の分子標的を研究し同定することは、植物の皮質微小管の制御についての新たな洞察を提供するはずである。同様に、ジソピラミドなどの歪んだ成長を促進するのに効果的な化学物質と、オリザリンやクマモト酸などのあまり効果のない化学物質との将来の比較は、歪んだ成長がどのように起こるのかについての手がかりを提供するでしょう。
一方、防御に関連した細胞骨格の再構成は、ウルソン酸の細胞毒性を説明する別の可能性です。病原体の感染または植物細胞へのエリシターの導入は、細胞骨格の破壊とその後の細胞死を引き起こすことがあります29。例えば、卵菌由来のクリプトキサンチンは、KAND 処理で起こるのと同様に、タバコ細胞が死ぬ前に微小管とアクチンフィラメントを破壊することが報告されています 30,31。クリプトキサンチンよりもウルソン酸の方が速くて強力な効果があることは明らかであるが、ウルソン酸によって誘発される防御反応と細胞反応の類似点から、それらが共通の細胞プロセスを引き起こすという仮説が立てられました。しかし、アクチンフィラメントの破壊は自然発生的な細胞死を促進することが研究によって示されており、これは常に微小管破壊を伴うわけではありません29。さらに、ウルソン酸誘導体のように、病原体またはエリシターのいずれかが根の成長の歪みを引き起こすかどうかはまだわかっていません。したがって、防御反応と細胞骨格を結び付ける分子的知識は、取り組むべき魅力的な問題である。ウルソン酸に関連する低分子量化合物やさまざまな効力を持つ一連の誘導体の存在を利用することで、未知の細胞機構を標的にする機会が得られる可能性があります。
総合すると、微小管の動態を調節する新しい化合物の発見と応用は、植物細胞の形状決定の根底にある複雑な分子機構に対処するための強力な方法を提供するでしょう。これに関連して、微小管とアクチンフィラメントに影響を与え、細胞死を誘導する最近開発された化合物ウルモトン酸は、微小管制御とこれらの他の機構との関係を解読する機会を提供する可能性がある。したがって、ウルベン酸を使用した化学的および生物学的分析は、植物の細胞骨格を制御する分子調節機構を理解するのに役立ちます。
2% (w/v) ガラクトース、2% (w/v) エッセンスペースト、1% (w/v) Bacto 組成物からなるシード培地 110 mL を含む 500 mL のバッフル付き三角フラスコに S. werraensis MK493-CF1 を接種します。 。-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.)、0.5% (w/v) トウモロコシ抽出物 (KOGOSTCH Co., Ltd.、日本)、0.2% (w/v) (NH4)2SO4 および 0.2% CaCO3 の脱イオン水溶液。(滅菌前はpH 7.4)。種培養物をロータリーシェーカー (180 rpm) 上で 27℃ で 2 日間インキュベートしました。固体発酵による生産培養。種培養物（7 ml）を、15 gの押し麦（MUSO Co., Ltd.、日本）および25 gの脱イオン水（pH未調整）からなる生産培地40 gを含む500 ml K-1フラスコに移した。滅菌前）。）。発酵は30℃、暗所で14日間行われました。発酵物質を４０ｍｌ／ボトルのＥｔＯＨで抽出し、遠心分離した（１５００ｇ、４℃、１０分間）。培養上清（６０ｍｌ）を１０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃの混合物で抽出した。有機層を減圧下で蒸発させて残留物 (59.5 mg) を得、これを逆相カラム (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120、5 μm、ID) での勾配溶出 (0 ～ 10 分: 90%) による HPLC に供しました。 10 mm × 長さ 250 mm) H2O/CH3CN、10 ～ 35 分: 90% H2O/CH3CN ～ 70% H2O/CH3CN (勾配)、35 ～ 45 分: 90% H2O/EtOH、45 ～ 155 分: 90% H2O /EtOH から 100% EtOH (勾配 (勾配)、155 ～ 200 分: 100% EtOH) を 1.5 ml/分の流速で反応させると、クマモナミド (1、36.0 mg) が白色非晶質粉末として単離されました。
クマモトアミド(1);1H-NMR (500 MHz、CDCl3) δ 6.93 (t、J = 2.5 Hz、1H)、6.76 (dd、J = 4.3、1.8 Hz 1H)、6.05 (t、J = 3.8 Hz、1H)。）、4.08（s、3H）;１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１６１．１、１２１．０、１１９．９、１１２．２、１０５．０、６８．３；ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ 計算値: 141.0659、測定値: 141.0663、IR νmax 3451、3414、3173、2938、1603、1593、1537 cm–1。
コロンビア種子 (Col-0) は、研究使用の許可を得てシロイヌナズナ生物資源センター (ABRC) から入手しました。Col-0 種子は、私たちの実験室条件下で繁殖および維持され、野生型シロイヌナズナ植物として使用されました。シロイヌナズナ種子を表面滅菌し、2% スクロース (富士フイルム和光純薬)、0.05% (w/v) 2-(4-モルホリノ)エタンスルホン酸 (MES) (富士フイルム和光純薬) を含む半強度の Murashige and Skoog 培地で培養しました。 ）。）および１．５％寒天（富士フイルム和光純薬）、ｐＨ５．７、２３℃、一定光下。phs1-1 変異体のシードは、橋本 T. (奈良先端科学技術大学院大学) より提供されました。
SR-1 株の種子は橋本哲也 (奈良先端科学技術大学院大学) から提供され、野生型タバコ植物として使用されました。タバコ種子の表面を滅菌し、発芽を促進するために滅菌水に 3 晩浸漬し、その後 2% スクロース、0.05% (w/v) MES、および 0.8% ジェランガム (富士フイルム和光純薬) を含む半濃度溶液に入れました。村重。およびSkoog培地）をpH 5.7で使用し、一定の光の下で23℃でインキュベートしました。
Tak-1 株は T. Kohchi (京都大学) によって提供され、ゼニゴケ研究の標準実験単位として使用されました。滅菌した培養植物から得たジェマを、1％スクロース、0.3％ジェランガムを含むガンボーグB5培地（富士フイルム和光純薬）に塗布し、23℃、連続光下でインキュベートした。
タバコ BY-2 細胞 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) は、S. Hasezawa (東京大学) から提供されました。BY-2 細胞を改変リンスマイヤーおよびスクーグ培地で 95 倍に希釈し、毎週 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸を補充しました 32 。細胞懸濁液をロータリーシェーカー上で１３０ｒｐｍ、２７℃、暗所で混合した。細胞を10倍量の新鮮な培地で洗浄し、同じ培地に再懸濁します。カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター下で微小管マーカーTagRFP-TUA6またはアクチンフィラメントマーカーGFP-ABD2を安定して発現するBY-2トランスジェニック細胞株を記載のように生成した33、34、35。これらの細胞株は、元の BY-2 細胞株に使用された手順と同様の手順を使用して維持および同期化できます。
HeLa細胞は、10％ウシ胎児血清、1.2U/mlペニシリン、および1.2μg/mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（Life Technologies）中で、5％CO2、37℃のインキュベーター内で培養した。
この原稿に記載されているすべての実験は、日本のバイオセーフティ規制およびガイドラインに従って実行されました。
化合物を原液としてジメチルスルホキシド（DMSO；富士フイルム和光純薬）に溶解し、シロイヌナズナおよびタバコの場合はMS培地、ゼニゴケの場合はガンボーグB5培地で希釈した。根の成長阻害アッセイでは、プレートあたり 10 個を超える種子を、指定の化合物または DMSO を含む寒天培地上に播種しました。種子を成長チャンバー内で 7 日間インキュベートしました。苗の写真を撮り、根の長さを測定しました。シロイヌナズナの発芽アッセイでは、プレートあたり 48 個の種子を 200 μM 化合物または DMSO を含む寒天培地上に播種しました。シロイヌナズナの種子を成長チャンバー内で栽培し、発芽後 7 日 (dag) に発芽した苗の数を数えました。タバコ発芽アッセイでは、プレートあたり 24 個の種子を 200 μM KAND または DMSO を含む寒天培地上に播種しました。タバコの種子を成長チャンバーで栽培し、14日後に発芽した苗の数を数えました。ゼニゴケの成長阻害アッセイでは、各プレートからの 9 個の胚を、指定濃度の KAND または DMSO を含む寒天培地上にプレーティングし、成長チャンバー内で 14 日間インキュベートしました。
根分裂組織の組織を視覚化するには、5 mg/ml ヨウ化プロピジウム (PI) で染色した苗を使用します。PIシグナルは、TCS SPE共焦点レーザー走査顕微鏡(Leica Microsystems)を使用した蛍光顕微鏡法によって観察した。
β-グルクロニダーゼ (GUS) による根の組織化学的染色は、Malami および Benfey 36 によって記載されたプロトコールに従って実行されました。苗木を９０％アセトン中で一晩固定し、ＧＵＳ緩衝液中の０．５ｍｇ／ｍｌの５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－ｄ－グルクロン酸で１時間染色し、水和クロルアルデヒド溶液中に置いた。(抱水クロラール 8 g、水 2 ml、グリセロール 1 ml) を混合し、Axio Imager M1 顕微鏡 (Carl Zeiss) を使用して微分干渉コントラスト顕微鏡で観察しました。
根の角度は、垂直に置かれたプレート上で生育した生後 7 日の実生苗で測定されました。ステップ 6 で説明したように、重力ベクトルの方向から根元の角度を測定します。
皮質微小管の配置は、プロトコルに若干の変更を加えて、記載どおりに観察されました 37 。抗βチューブリン抗体 (KMX-1、Merk Millipore: MAB3408) および Alexa Fluor 488 結合抗マウス IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) を 1:1000 および 1:100 の希釈率で一次抗体および二次抗体として使用しました。それぞれ。蛍光画像は、TCS SPE 共焦点レーザー走査顕微鏡 (Leica Microsystems) を使用して取得しました。メーカーの指示に従って、Z スタック画像を取得し、最大強度投影を作成します。
HeLa細胞増殖アッセイは、Cell Counting Kit 8 (Dojindo)を使用して、製造業者の指示に従って実施した。
大腸菌 DH5α の増殖は、分光光度計を使用して 600 nm (OD600) で培養中の細胞密度を測定することによって分析されました。
トランスジェニック BY-2 細胞の細胞骨格組織は、CSU-X1 共焦点走査装置 (横河電機) と sCMOS カメラ (Zyla、Andor Technology) を備えた蛍光顕微鏡を使用して観察されました。細胞骨格密度は、記載されているように ImageJ ソフトウェアを使用して共焦点画像内の細胞質ピクセル中の細胞骨格ピクセルの割合を定量化する画像分析によって評価されました 38,39。
BY-2 細胞の細胞死を検出するために、細胞懸濁液のアリコートを 0.05% エバンス ブルーとともに室温で 10 分間インキュベートしました。死細胞の選択的エバンスブルー染色は、無傷の原形質膜による生細胞からの色素の押し出しに依存します40。明視野顕微鏡（BX53、オリンパス）を使用して、染色された細胞を観察した。
HeLa 細胞は、37℃、5% CO2 の加湿インキュベーター内で、10% FBS を添加した DMEM 中で増殖させました。細胞を100μM KAND 11、クマモナミド6、クマモナミド1、100 ng/ml コルセミド (Gibco)、または100 ng/ml Nocodmaze (Sigma)で37℃で6時間処理した。細胞を室温でMetOHで10分間固定し、次に酢酸塩で5分間固定した。固定細胞を、0.5% BSA/PBS で希釈した β-チューブリン一次抗体 (1D4A4、Proteintech: 66240-1) とともに 2 時間インキュベートし、TBST で 3 回洗浄し、次に Alexa Fluor ヤギ抗体とともにインキュベートしました。488 1時間。– マウス IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) および 0.5% BSA/PBS で希釈した 15 ng/ml 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)。TBSTで3回洗浄した後、染色された細胞をNikon Eclipse Ti-E倒立顕微鏡で観察しました。画像は、MetaMorph ソフトウェア (Molecular Devices) を使用して、冷却されたハママツ ORCA-R2 CCD カメラでキャプチャされました。
投稿日時: 2024 年 6 月 17 日