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天然物の発見と有益な利用は、人々の生活の向上に貢献します。植物成長阻害化学物質は、雑草を防除するための除草剤として広く使用されています。様々な種類の除草剤を使用する必要があるため、新たな作用機序を持つ化合物を同定する必要があります。本研究では、Streptomyces werraensis MK493-CF1から新規N-アルコキシピロール化合物であるクマモナミドを発見し、その完全合成プロセスを確立しました。生物活性試験により、ウルスモノアミドがウルスモノアミドの合成中間体であり、潜在的な抗酸化物質であることがわかりました。植物成長抑制剤さらに、HeLa細胞の生育に悪影響を与えることなく高い除草活性を示すウルベニルオキシ誘導体（UDA）を含む、様々なウルベノン酸誘導体を開発しました。また、ウルモトニック酸誘導体が植物の微小管を阻害すること、さらにKANDがアクチンフィラメントに作用して細胞死を誘導することを発見しました。これらの多面的な作用は、既存の微小管阻害剤とは異なるウルソン酸の新たな作用機序を示唆しており、新規除草剤開発において重要な利点となります。
有益な天然物とその誘導体の発見と実用化は、人々の生活の質を向上させる手段です。微生物、植物、昆虫が生産する二次代謝産物は、医学と農業に大きな進歩をもたらしました。多くの抗生物質や抗白血病薬が天然物から開発されています。さらに、様々な種類の農薬これらの天然物から、農業用に殺菌剤や除草剤が抽出されています。特に、雑草防除剤は現代農業において作物の収量増加に重要なツールであり、様々な化合物が既に商業的に使用されています。植物における細胞プロセス、例えば光合成、アミノ酸代謝、細胞壁合成、有糸分裂の調節、植物ホルモンシグナル伝達、タンパク質合成などは、除草剤の典型的な標的と考えられています。微小管機能を阻害する化合物は、有糸分裂の調節に作用することで植物の成長に影響を与える一般的な除草剤です2。
微小管は細胞骨格の構成要素であり、真核細胞において広く保存されています。チューブリンヘテロダイマーは、α-チューブリンとβ-チューブリンから構成され、直線状の微小管プロトフィラメントを形成し、13本のプロトフィラメントが円筒状の構造を形成します。植物細胞において、微小管は細胞の形状決定、細胞分裂、細胞内輸送など、多様な役割を果たしています3,4。植物細胞は、間期細胞膜直下に微小管を有しており、これらのいわゆる表層微小管は、セルロース合成酵素複合体の制御を介してセルロースミクロフィブリルの組織化を制御していると考えられています4,5。根端の急速伸長領域に存在する根表皮細胞の表層微小管は、側方に位置しており、セルロースミクロフィブリルはこれらの微小管に沿って移動することで細胞の伸長方向を制限し、異方的な細胞伸長を促進します。したがって、微小管の機能は植物形態と密接に関連しています。チューブリンをコードする遺伝子におけるアミノ酸置換は、シロイヌナズナにおいて、表層微小管配列の歪みと左向きまたは右向きの成長を引き起こします6,7。同様に、微小管の動態を制御する微小管関連タンパク質の変異も、根の成長の歪みにつながる可能性があります8,9,10,11,12,13。さらに、プレチラクロールとしても知られるジソピラミドなどの微小管阻害性除草剤の処理も、左向きの斜め根の成長を引き起こします14。これらのデータは、微小管機能の正確な制御が植物の成長方向を決定する上で重要であることを示しています。
様々な種類の微小管阻害剤が発見されており、これらの薬剤は細胞骨格研究だけでなく、農業や医療にも大きく貢献してきました2。特に、オリザリン、ジニトロアニリン化合物、ジソピラミド、ベンザミド関連化合物、およびそれらの類似体は、微小管の機能を阻害することで植物の成長を阻害することができるため、除草剤として広く使用されています。しかし、微小管は植物細胞と動物細胞の重要な構成要素であるため、ほとんどの微小管阻害剤は両方の細胞に対して細胞毒性を示します。そのため、除草剤としての有用性が認められているにもかかわらず、実用的に使用されている微小管阻害薬は限られています。
ストレプトマイセスは、好気性グラム陽性糸状細菌を含むストレプトマイセス科の属であり、幅広い二次代謝産物を産生することで広く知られています。そのため、ストレプトマイセスは新しい生物活性天然物の最も重要な供給源の一つと考えられています。本研究では、ストレプトマイセス・ウェラエンシスMK493-CF1株およびS. ウェラエンシスISP 5486株から単離されたクマモナミドと呼ばれる新規化合物を発見しました。スペクトル解析およびフルスペクトル解析を用いてクマモナミドの構造を解析し、その独特なN-アルコキシピロール骨格を決定しました。合成。ウルスモノアミドおよびその誘導体の合成中間体であるウルスモン酸は、一般的なモデル植物であるシロイヌナズナの生育と発芽を阻害することがわかりました。構造活性相関研究において、ウルソン酸のC9位を修飾した化合物（ウルソン酸ノニルオキシ誘導体（KAND））が、植物の成長と発芽に対する阻害効果を著しく増強することを発見しました。注目すべきことに、この新たに発見された植物成長阻害剤は、タバコと苔類の成長にも影響を与え、細菌やHeLa細胞に対しては細胞毒性を示さなかった。さらに、ウルソン酸誘導体の中には、根の表現型に歪みを生じさせるものがあり、これらの誘導体が直接的または間接的に微小管に影響を及ぼすことが示唆されています。この考えと一致して、免疫組織化学的または蛍光タンパク質で標識した微小管の観察から、KAND処理によって微小管が脱重合されることが示唆されました。さらに、ウルソン酸誘導体による処理はアクチンミクロフィラメントを破壊しました。このように、細胞骨格の破壊を伴う独自の作用機序を持つ、新たな植物成長阻害剤を発見したことになります。
MK493-CF1株は、東京都品川区の土壌から分離され、よく分枝した間質菌糸を形成しました。16SリボソームRNA遺伝子（1422 bp）の部分配列が決定されました。本株はS. werraensis（NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: 代表株, 99.93%）と非常に類似しています。この結果に基づき、本株はS. werraensisの基準株に近縁であると判断されました。したがって、本株をS. werraensis MK493-CF1と仮命名しました。S. werraensis ISP 5486T株も同様の生理活性物質を生産します。この微生物から天然物を得る研究はこれまでほとんど行われていなかったため、更なる化学的研究が行われました。 S. werraensis MK493-CF1を大麦培地で30℃、14日間固体発酵させた後、培地を50%エタノールで抽出した。サンプル60 mlを乾燥させ、粗抽出物59.5 mgを得た。粗抽出物を逆相HPLCで分離し、N-メトキシ-1H-ピロール-2-カルボキサミド（1、クマモナミドと命名、36.0 mg）を得た。1の総量は粗抽出物の約60%に相当する。そこで、クマモナミド1の詳細な性質を検討することにした。
クマモナミド1は白色の非晶質粉末であり、高分解能質量分析（HRESIMS）によりC6H8N2O2であることが確認された（図1）。この化合物のC2置換ピロールフラグメントは、δH 6.94（1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4）、δH 6.78（1H, d, J = 2.5、1H NMRスペクトルのδH：4.5 Hz, H-5）、およびδH 6.78（1H, d, J = 2.5 Hz, H-6）で特徴付けられ、13C NMRスペクトルは4つのsp2炭素原子の存在を示している。C2位のアミド基の存在は、C-3プロトンからアミドカルボニル炭素（δC 161.1）までのHMBC相関によって評価された。さらに、δH 4.10（3H, S）およびδC 68.3の1 Hおよび13 C NMRピークは、分子中にN-メトキシ基が存在することを示唆している。メトキシ基の正確な位置は、増強差分光法や核オーバーハウザー略語法（NOEDF）などの分光分析を用いてはまだ決定されていなかったものの、N-メトキシ-1H-ピロール-2-カルボキサミドが最初の候補化合物となった。
1 の正しい構造を決定するために、全合成を行った（図 2a）。市販の 2-アミノピリジン 2 を m-CPBA で処理すると、対応する N-オキシド 3 が定量的収率で得られた。 2 の 2-アミノアジド化後、Abramovich によって記載された縮環反応をベンゼン中 90°C で実行して、目的の 1-ヒドロキシ-1H-ピロール-2-カルボニトリル 5 をグラム単位で得た。速度 60%（2 段階）。15,16。次に、4 のメチル化および加水分解により、1-メトキシ-1H-ピロール-2-カルボン酸（「クモトン酸」と呼ばれる、6）が良好な収率（70%、2段階）で得られた。最後に、アンモニア水を使用して酸塩化物中間体 6 を経由するアミド化により、熊本アミド 1 が 98% の収率で得られた。合成された 1 のすべてのスペクトルデータは単離された 1 と類似していたため、 1 の構造を決定しました。
ウルベナミドおよびウルベン酸の一般的な合成と生物活性の分析。(a) クマモナミドの全合成。(b) 7日齢の野生型シロイヌナズナコロンビア（Col）実生を、クマモナミド6またはクマモナミド1を記載濃度で含むムラシゲ・スクーグ（MS）プレート上で生育させた。スケールバー = 1 cm。
まず、ウルベナミドおよびその中間体の植物生長調節能について、生物活性を評価しました。様々な濃度のウルスモナミド1またはウルスモン酸6をMS寒天培地に添加し、この培地でシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の実生を培養しました。これらの試験の結果、高濃度（500 μM）のウルスモナミド1は根の成長を阻害することが示されました（図2b）。次に、ウルスモナミド6のN1位を置換した様々な誘導体を作製し、それらの構造活性相関試験を行いました（類似体の合成プロセスは補足情報（SI）に記載されています）。シロイヌナズナの実生を50 μMのウルスモナミド誘導体を含む培地で生育させ、根の長さを測定しました（写真参照）。図3a、b、およびS1に示すように、クマモ酸はN1位に異なる長さの直鎖アルコキシ鎖（9、10、11、12、および13）または大きなアルコキシ鎖（15、16、および17）を有する。これらの誘導体は根の成長を顕著に阻害した。さらに、10、11、または17を200μMで処理すると発芽が阻害されることがわかった（図3cおよびS2）。
クマモナミドおよび関連化合物の構造活性相関に関する研究。(a) 類似体の構造と合成スキーム。(b) 50 μMクマモナミド誘導体を含むまたは含まないMS培地で生育した7日齢の実生の根長の定量。アスタリスクは、偽処理との有意差を示す（t検定、p< 0.05）。18. データは平均値±標準偏差で示されている。ntは、種子の50%以上が発芽しなかったため「未試験」を意味する。(c) 200μMクマモナミドおよび関連化合物を含む、または含まないMS培地で7日間培養した処理済み種子の発芽率の定量化。アスタリスクは、偽処理（カイ二乗検定）との有意差を示す。n=96。
興味深いことに、C9 より長いアルキル側鎖を付加すると阻害活性が低下し、熊本酸関連化合物が生物学的活性を発揮するには一定の大きさの側鎖が必要であることが示唆されました。
構造活性相関解析の結果、C9がウルソン酸に修飾され、ウルソン酸のノニルオキシ誘導体（以下、KAND 11）が最も効果的な植物成長阻害物質であることが示されたため、KAND 11のより詳細な特性解析を行った。アラビドプシスを50μMのKAND 11で処理すると発芽がほぼ完全に阻害されたが、低濃度（40、30、20、または10μM）のKAND 11では、用量依存的に根の成長が阻害された（図4a、b）。KAND 11が根端分裂組織の生存率に影響を与えるかどうかを調べるため、ヨウ化プロピジウム（PI）で染色した根端分裂組織を観察し、分裂組織面積を測定した。 25 μM KAND-11を含む培地で生育した実生の分裂組織の大きさは151.1 ± 32.5 μmであったのに対し、DMSOを含む対照培地で生育した実生の分裂組織の大きさは264.7 ± 30.8 μmであった（図4c、d）。これは、KAND-11が細胞活動を回復させることを示しています。 根端分裂組織。これに一致して、KAND 11処理は根端分裂組織における細胞分裂マーカーCDKB2;1p::CDKB2;1-GUSシグナルの量を減らしました（図4e）17 。これらの結果は、KAND 11が細胞増殖活性を減らすことによって根の成長を阻害することを示しています。
ウルベノン酸誘導体（ウルベニルオキシ誘導体）による生育阻害効果の解析。（a）MSプレートでKAND 11の濃度で生育した7日齢の野生型Col実生。スケールバー＝1 cm。（b）根長の定量。文字は有意差を示す（Tukey HSD検定、p< 0.05）。16. データは平均±SDとして示されている。(c) 25 μM KAND 11添加の有無にかかわらずMSプレート上で生育したプロピジウムヨウ化物染色野生型Col根の共焦点顕微鏡写真。白い括弧は根端分裂組織を示す。スケールバー＝100 µm。(d) 根端分裂組織の大きさの定量化（n = 10～11）。統計的有意差はt検定（p = 0.0001）を用いて判定した。棒グラフは分裂組織の平均サイズを表す。（e）CDKB2コンストラクト（1pro：CDKB2、1-GUS染色）を含む根端分裂組織の微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡写真。MSプレート上で25 µM KANDアッセイの有無で生育した5日齢の実生を染色したもの。
KAND 11の植物毒性は、別の双子葉植物であるタバコ（Nicotiana tabacum）と、主要な陸上植物モデル生物であるゼニゴケ（Marchantia polymorpha）を用いてさらに試験された。シロイヌナズナの場合と同様に、25μM KAND 11を含む培地で生育したタバコSR-1実生は、根が短くなった（図5a）。さらに、200μM KAND 11を含む培地では48粒中40粒が発芽したのに対し、模擬培地では48粒すべてが発芽したことから、KAND濃度が高いほど毒性が顕著であることが示された（pKAND 11は、タバコの発芽を阻害した（図5b）。また、ゼニゴケにおける細菌の増殖を阻害したKAND 11の濃度は、シロイヌナズナにおける有効濃度と同程度であった（図5c）。これらの結果は、KAND 11がさまざまな植物の生育を阻害できることを示している。次に、クマモノアミド関連化合物の細胞毒性を、高等動物細胞と細菌細胞の代表として、他の生物、すなわちヒトHeLa細胞と大腸菌DH5α株で調べた。一連の細胞増殖アッセイでは、クマモナミド1、クマモナミジン酸6、およびKAND 11は、100μMの濃度ではHeLa細胞や大腸菌細胞の増殖に影響を与えないことが観察された（図5d、e）。
非シロイヌナズナ生物におけるKAND 11の生育阻害。(a) 2週齢の野生型SR-1タバコ実生を、25 μM KAND 11を含む垂直に置いたMSプレート上で生育させた。(b) 2週齢の野生型SR-1タバコ実生を、200 μM KAND 11を含む水平に置いたMSプレート上で生育させた。(c) 2週齢の野生型Tak-1ゼニゴケの芽を、表示濃度のKAND 11を含むGamborg B5プレート上で生育させた。赤い矢印は、2週間の培養期間内に生育を停止した胞子を示す。(d) HeLa細胞の細胞増殖アッセイ。一定時間間隔で、細胞計数キット8（Dojindo）を使用して生細胞数を測定した。対照として、RNAポリメラーゼ転写を阻害し細胞死を引き起こすアクチノマイシンD（Act D）5 μg/mlでHeLa細胞を処理した。分析は3回繰り返して実施した。(e) 大腸菌細胞増殖アッセイ。大腸菌の増殖はOD600を測定することで分析した。対照として、細菌細胞壁合成を阻害するアンピシリン（Amp）50μg/mlを細胞に処理した。分析は3回繰り返して実施した。
ウラミド関連化合物による細胞毒性の作用機序を解明するため、中等度の阻害効果を持つウルベン酸誘導体を再解析しました。その結果を図に示します。図2b、6aに示すように、高濃度（200 μM）のウルモトニック酸6を含む寒天培地で生育した実生は、短く左に曲がった根（θ = – 23.7 ± 6.1）を形成しましたが、対照培地で生育した実生はほぼ真っ直ぐな根（θ = – 3.8 ± 7.1）を形成しました。この特徴的な斜めの成長は、表層微小管の機能不全に起因することが知られています14,18。この知見と一致して、微小管不安定化薬であるジソピラミドとオリザリンは、我々の生育条件下で同様の根の傾斜を引き起こしました（図2b、6a）。同時に、ウルソール酸誘導体を試験し、特定の濃度で斜めの根の成長を誘導するものをいくつか選択した。化合物8、9、15は、それぞれ75μM、50μM、40μMで根の成長方向を変えたことから、これらの化合物が微小管を効果的に不安定化できることがわかった（図2b、6a）。また、最も強力なウルソール酸誘導体であるKAND 11を低濃度（15μM）で試験したところ、KAND 11の施用により根の成長が阻害され、根の成長方向は左に傾斜する傾向はあるものの不均一であることがわかった（図C3）。高濃度の微小管不安定化薬は、根の傾斜を引き起こすのではなく、植物の成長を阻害することがあるため、次に、根の表皮細胞の表層微小管を観察することにより、KAND 11が微小管に影響を及ぼす可能性を評価した。 25μM KAND 11で処理した実生根の表皮細胞において、抗β-チューブリン抗体を用いた免疫組織化学染色により、伸長帯の表皮細胞におけるほぼ全ての表層微小管が消失していることが示された（図6b）。これらの結果は、クマモトニック酸およびその誘導体が微小管に直接または間接的に作用して破壊すること、そしてこれらの化合物が新規な微小管阻害剤であることを示唆している。
ウルソン酸とその誘導体は、シロイヌナズナの表層微小管を変化させる。(a) ウルソン酸誘導体を各種濃度で存在させた状態で測定した根の傾斜角。微小管を阻害することが知られている2つの化合物、ジソピラミドとオリザリンの効果も分析した。挿入図は、根の成長角を測定するために使用した基準値を示す。アスタリスクは、偽処理との有意差を示す（t検定、p< 0.05）。19. スケールバー = 1 cm。(b) 伸長ゾーンの表皮細胞における表層微小管。MSプレート上で25 μM KAND 11の有無で生育した野生型Arabidopsis Colの根における微小管を、β-チューブリン一次抗体およびAlexa Fluor標識二次抗体を用いた免疫組織化学染色により可視化した。スケールバー = 10 µm。(c) 根端分裂組織における微小管の有糸分裂構造。微小管は免疫組織化学染色を用いて可視化した。前期ゾーン、紡錘体、隔膜形成体を含む有糸分裂構造は共焦点画像から計数した。矢印は有糸分裂微小管構造を示す。アスタリスクはsham処理との有意差を示す（t検定、p< 0.05）。9. スケールバー = 50 µm。
Ursaは微小管機能を破壊する能力を有するものの、その作用機序は一般的な微小管脱重合剤とは異なると予想されます。例えば、ジソピラミドやオリザリンなどの微小管脱重合剤は高濃度で表皮細胞の異方性伸長を引き起こしますが、KAND 11はそのような作用を示しません。さらに、KAND 11とジソピラミドを併用すると、ジソピラミド誘導性の根の成長反応とKAND 11誘導性の生育阻害が同時に観察されました（図S4）。また、KAND 11に対する過敏性ジソピラミド1-1（phs1-1）変異体の反応も解析しました。phs1-1は非典型的なチューブリンキナーゼの点変異を有しており、ジソピラミド処理によって根が短くなります9,20。 KAND 11を含む寒天培地で生育したphs1-1変異体の実生は、ディソピラミドで生育したものと同様に根が短かった（図S5）。
さらに、KAND 11 で処理した実生の根端分裂組織では、前期領域、紡錘体、隔膜形成体などの有糸分裂微小管構造が観察されました。CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS の観察結果と一致して、有糸分裂微小管の数の大幅な減少が観察されました (図 6c)。
KAND 11の細胞毒性を細胞レベル以下で評価するため、タバコBY-2懸濁細胞をKAND 11で処理し、その反応を観察した。まず、微小管を蛍光標識するTagRFP-TUA6を発現するBY-2細胞にKAND 11を添加し、KAND 11の表層微小管に対する効果を評価した。表層微小管密度は、細胞質ピクセルに対する細胞骨格ピクセルの割合を定量化する画像解析を用いて評価した。アッセイの結果、50 μMまたは100 μMのKAND 11で1時間処理した後、密度はそれぞれ0.94 ± 0.74%または0.23 ± 0.28%に有意に減少したのに対し、DMSOで処理した細胞の密度は1.61 ± 0.34%であった（図7a）。これらの結果は、KAND 11処理が表層微小管の脱重合を誘導するというシロイヌナズナにおける観察結果と一致している（図6b）。また、同じ濃度のKAND 11処理後のGFP-ABD標識アクチンフィラメントを有するBY-2細胞株を調べたところ、KAND 11処理がアクチンフィラメントを破壊したことが観察された。50 μMまたは100 μMのKAND 11で1時間処理すると、アクチンフィラメント密度はそれぞれ1.20 ± 0.62%または0.61 ± 0.26%に有意に減少したのに対し、DMSO処理細胞での密度は1.69 ± 0.51%であった（図2）。 7b）。これらの結果は、アクチンフィラメントに影響を与えないプロピザミド、および微小管に影響を与えないアクチン脱重合剤ラトランキュリンBの影響とは対照的である（SI図S6）。さらに、クマモナミド 1、クマモナミド酸 6、または KAND 11 による処理は、HeLa 細胞の微小管に影響を与えなかった (SI 図 S7)。したがって、KAND 11 の作用機序は、既知の細胞骨格攪乱剤とは異なると考えられます。さらに、KAND 11 で処理した BY-2 細胞の顕微鏡観察により、KAND 11 処理中に細胞死が開始され、エバンスブルー染色された死細胞の割合は KAND 11 処理 30 分後には有意に増加しなかったのに対し、50 μM または 100 μM の KAND で 90 分処理した後には、死細胞の数がそれぞれ 43.7% または 80.1% に増加したことが示されました (図 7c)。これらのデータを総合すると、新規ウルソール酸誘導体 KAND 11 は、これまで作用機序が知られていなかった植物特異的な細胞骨格阻害剤であることが示唆されます。
KANDはタバコBY-2細胞の表層微小管、アクチンフィラメント、および生存率に影響を与える。(a) TagRFP-TUA6存在下でのBY-2細胞における表層微小管の可視化。KAND 11（50 μMまたは100 μM）またはDMSOで処理したBY-2細胞を共焦点顕微鏡で観察した。表層微小管密度は25個の独立した細胞の顕微鏡写真から算出した。文字は有意差を示す（Tukey HSD検定、pスケールバー = 10 µm。(b) GFP-ABD2存在下で可視化したBY-2細胞の皮質アクチンフィラメント。KAND 11 (50 µMまたは100 µM)またはDMSOで処理したBY-2細胞を共焦点顕微鏡で観察した。皮質アクチンフィラメントの密度は、25個の独立した細胞の顕微鏡写真から計算した。文字は有意差を示す（Tukey HSD検定、p（c）エバンスブルー染色によるBY-2細胞の死滅観察。KAND 11（50 μMまたは100 μM）またはDMSOで処理したBY-2細胞を明視野顕微鏡で観察した。n＝3。スケールバー＝100 μm。
新たな天然物質の発見と応用は、医療や農業を含む人類生活の様々な側面に大きな進歩をもたらしてきました。天然資源から有用な化合物を得るための研究は、歴史的に行われてきました。特に放線菌は、イベルメクチンのリード化合物であるアベルメクチンや、抗がん剤として医療に用いられるブレオマイシンおよびその誘導体など、様々な二次代謝産物を産生する能力を持つことから、線虫に対する抗寄生虫抗生物質として有用であることが知られています21,22。同様に、放線菌からは様々な除草剤化合物が発見されており、その一部は既に商業的に利用されています1,23。したがって、放線菌代謝産物の分析から、所望の生物活性を有する天然物質を単離することは、効果的な戦略と考えられています。本研究では、S. werraensisから新規化合物クマモナミドを発見し、その合成に成功しました。ウルソン酸は、ウルベナミドおよびその誘導体の合成中間体です。ウルモトニック酸は、特徴的な根の巻き込みを引き起こし、中程度から強い除草活性を示し、植物の微小管に直接的または間接的に損傷を与えます。しかし、KAND 11はアクチンフィラメントを破壊して細胞死を引き起こすことから、ウルモトニック酸の作用機序は既存の微小管阻害剤とは異なる可能性があります。これは、ウルモトニック酸とその誘導体が広範な細胞骨格構造に影響を及ぼす制御機構を示唆しています。
ウルベノン酸の詳細な特性解析は、ウルベノン酸の作用機序をより深く理解する上で役立つでしょう。特に、ウルソン酸の還元型微小管への結合能を評価し、ウルソン酸およびその誘導体が微小管に直接作用して脱重合させるのか、それとも微小管の不安定化をもたらすのかを明らかにすることが次の目標です。さらに、微小管が直接的な標的でない場合は、植物細胞におけるウルソン酸の作用部位と分子標的を特定することで、関連化合物の特性をさらに理解し、除草活性を向上させるための方法を探ることができます。私たちの生物活性試験では、ウルソン酸がシロイヌナズナ、タバコ、苔類などの植物の成長に対して特異的な細胞毒性を示すことが明らかになりましたが、大腸菌やHeLa細胞には影響が見られませんでした。動物細胞への毒性がほとんどないか全くないことは、ウルソン酸誘導体を露地農地用除草剤として開発する場合の利点となります。実際、微小管は真核生物に共通する構造であるため、植物におけるその選択的阻害は除草剤の重要な要件です。例えば、チューブリンに直接結合して重合を阻害する微小管脱重合剤であるプロピザミドは、動物細胞への毒性が低いことから除草剤として使用されています24。ジソピラミドとは対照的に、関連ベンズアミドは異なる標的特異性を有しています。植物微小管に加えて、RH-4032やベンゾキサミドはそれぞれ動物細胞や卵菌の微小管も阻害します。また、ザリラミドは植物毒性が低いことから殺菌剤として使用されています25,26,27。新たに発見されたベアーとその誘導体は植物に対して選択的な細胞毒性を示しますが、さらなる改変によって標的特異性が変化し、病原性真菌や卵菌の防除のための新たな誘導体を提供できる可能性があることは注目に値します。
ウルベノン酸とその誘導体のユニークな特性は、除草剤としての開発や研究ツールとしての利用に有用です。植物細胞の形状制御における細胞骨格の重要性は広く認識されています。これまでの研究で、植物は形態形成を適切に制御するために、微小管の動態を制御することで、表層微小管の複雑な組織化メカニズムを進化させてきたことが示されています。微小管の活性制御に関与する多数の分子が同定されており、関連する研究は現在も進行中です3,4,28。植物細胞における微小管の動態に関する現在の理解は、表層微小管の組織化メカニズムを完全には説明していません。例えば、ジソピラミドとオリザリンはどちらも微小管を脱重合させることができますが、ジソピラミドは根に深刻な変形を引き起こすのに対し、オリザリンは比較的穏やかな影響しか及ぼしません。さらに、微小管を安定化させるチューブリンの変異は根の右旋性も引き起こしますが、同様に微小管の動態を安定化させるパクリタキセルは右旋性を引き起こしません。したがって、ウルソール酸の分子標的を研究・特定することで、植物の表層微小管の制御に関する新たな知見が得られると期待されます。同様に、ジソピラミドなど歪んだ成長を促進するのに効果的な化学物質と、オリザリンやクマモトリン酸など効果の低い化学物質との比較研究を進めることで、歪んだ成長がどのように起こるのかを解明する手がかりが得られるでしょう。
一方、防御に関連した細胞骨格の再編成は、ウルソン酸の細胞毒性を説明するもう一つの可能性である。病原体の感染やエリシターの植物細胞への導入は、細胞骨格の破壊とそれに続く細胞死を引き起こすことがある29。例えば、卵菌由来のクリプトキサンチンは、タバコ細胞死に先立って微小管とアクチンフィラメントを破壊することが報告されており、これはKAND処理で起こる現象に類似している30,31。ウルソン酸によって誘導される防御反応と細胞反応の類似性から、ウルソン酸はクリプトキサンチンよりも速く強い効果を示すことが明らかであるものの、両者は共通の細胞プロセスを誘導するのではないかとの仮説が立てられた。しかしながら、アクチンフィラメントの破壊は自発的な細胞死を促進し、必ずしも微小管の破壊を伴うわけではないことが研究で示されている29。さらに、病原体またはエリシターがウルソン酸誘導体のように根の成長を阻害するかどうかは、まだ解明されていない。このように、防御反応と細胞骨格を結びつける分子レベルの知識は、取り組むべき魅力的な課題です。ウルソン酸に関連する低分子量化合物や、様々な効力を持つ様々な誘導体の存在を活用することで、未知の細胞メカニズムを標的とする研究の機会が生まれる可能性があります。
微小管の動態を調節する新規化合物の発見と応用は、植物細胞の形態決定の基盤となる複雑な分子機構を解明するための強力な手段となるでしょう。この文脈において、微小管とアクチンフィラメントに作用し細胞死を誘導する最近開発された化合物、ウルモトニック酸は、微小管制御とこれらの他の機構との関連性を解明する機会となる可能性があります。したがって、ウルモトニック酸を用いた化学的・生物学的分析は、植物細胞骨格を制御する分子制御機構の理解に役立つでしょう。
S. werraensis MK493-CF1を、2% (w/v)ガラクトース、2% (w/v)エッセンスペースト、1% (w/v)バクトコンポジション（Thermo Fisher Scientific, Inc.）、0.5% (w/v)コーンエキス（KOGOSTCH Co., Ltd., Japan）、0.2% (w/v)(NH4)2SO4、および0.2% CaCO3を含む脱イオン水（滅菌前pH 7.4）を含むシード培地110 mLを入れた500 mLバッフル付き三角フラスコに接種する。シード培養は、ロータリーシェーカー（180 rpm）で27℃、2日間培養した。生産培養は固体発酵により行った。種培養液（7 ml）を、圧搾大麦（MUSO社、日本）15 gと脱イオン水（滅菌前にpH調整なし）25 gからなる生産培地40 gを入れた500 ml K-1フラスコに移した。発酵は暗所で30℃、14日間行った。発酵物質を40 ml/ボトルのエタノールで抽出し、遠心分離（1500 g、4℃、10分）した。培養上清（60 ml）を10% MeOH/EtOAc混合液で抽出した。有機層は減圧下で蒸発させて残渣（59.5 mg）を得、これを逆相カラム（SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120、5 μm、ID 10 mm × 長さ 250 mm）H2O/CH3CN、10～35分：90％ H2O/CH3CN～70％ H2O/CH3CN（グラジエント）、35～45分：90％ H2O/EtOH、45～155分：90％ H2O/EtOH～100％ EtOH（グラジエント（グラジエント）、155～200分：100％ EtOH）でグラジエント溶出（0～10分：90％）のHPLCに供し、流速1.5 ml/分でクマモナミド（1、36.0 mg）を白色非晶質粉末として単離した。
クモマミド(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ 計算値: 141.0659、測定値: 141.0663、IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1。
コロンビア種子（Col-0）は、シロイヌナズナ生物資源センター（ABRC）から研究利用の許可を得て入手しました。Col-0種子は当研究所の実験室環境で増殖・維持され、野生型のシロイヌナズナとして使用されました。シロイヌナズナ種子は表面滅菌後、2%スクロース（富士フイルム和光純薬）、0.05%（w/v）2-（4-モルフォリノ）エタンスルホン酸（MES）（富士フイルム和光純薬）、1.5%寒天（富士フイルム和光純薬）を含む半濃度Murashige and Skoog培地（pH 5.7）で、23℃、一定光条件下で培養しました。phs1-1変異体の種子は、奈良先端科学技術大学院大学の橋本剛志氏より提供されました。
SR-1株の種子は、奈良先端科学技術大学院大学の橋本剛志氏より提供され、野生型タバコ植物として用いた。タバコ種子は表面殺菌後、発芽促進のため滅菌水に3晩浸漬した後、2%ショ糖、0.05% (w/v) MES、0.8%ジェランガム（富士フイルム和光純薬）を含むpH5.7の半濃度溶液（ムラシゲ・アンド・スクーグ培地）に播種し、23℃、定常光下で培養した。
Tak-1株は、京都大学のT. Kohchi氏から提供され、ゼニゴケ研究の標準実験単位として使用されました。Gemmaは滅菌培養植物から採取し、1%スクロースおよび0.3%ジェランガムを含むGamborg B5培地（富士フイルム和光純薬）に播種し、23℃、連続光下で培養しました。
タバコBY-2細胞（Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2）は、長谷澤 誠（東京大学）より提供された。BY-2細胞を改変リンスマイヤー・スクーグ培地で95倍希釈し、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸32を毎週補充した。細胞懸濁液をロータリーシェーカーで130 rpm、27°Cで暗所で撹拌した。細胞を10倍量の新鮮培地で洗浄し、同じ培地に再懸濁した。カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター下で微小管マーカーTagRFP-TUA6またはアクチンフィラメントマーカーGFP-ABD2を安定発現するBY-2トランスジェニック細胞株を、記載の通りに生成した33,34,35。これらの細胞株は、元のBY-2細胞株に使用した手順と同様の手順で維持および同期化することができる。
HeLa 細胞は、10% ウシ胎児血清、1.2 U/ml ペニシリン、1.2 μg/ml ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) (Life Technologies) で、37°C インキュベーター内で 5% CO2 で培養されました。
この原稿に記載されているすべての実験は、日本のバイオセーフティ規制およびガイドラインに従って実施されました。
化合物はジメチルスルホキシド（DMSO、富士フイルム和光純薬）に溶解してストック溶液とし、シロイヌナズナおよびタバコについてはMS培地、ゼニゴケについてはGamborg B5培地で希釈した。根成長阻害アッセイでは、指定の化合物またはDMSOを含む寒天培地に1プレートあたり10粒以上の種子を播種した。種子は生育チャンバー内で7日間培養した。幼苗を撮影し、根の長さを測定した。シロイヌナズナ発芽アッセイでは、200 μMの化合物またはDMSOを含む寒天培地に1プレートあたり48粒の種子を播種した。シロイヌナズナの種子を生育チャンバー内で生育させ、発芽後7日目（dag）に発芽した幼苗の数を数えた。タバコ発芽アッセイでは、200 μMのKANDまたはDMSOを含む寒天培地に1プレートあたり24粒の種子を播種した。タバコの種子をグロースチャンバーで栽培し、14日後に発芽した実生の数を数えた。ゼニゴケ生育阻害試験では、各プレートから9個の胚を、指示された濃度のKANDまたはDMSOを含む寒天培地に播種し、グロースチャンバーで14日間培養した。
5 mg/ml ヨウ化プロピジウム（PI）で染色した苗を用いて、根端分裂組織の組織を可視化しました。PIシグナルは、TCS SPE共焦点レーザー走査顕微鏡（Leica Microsystems）を用いた蛍光顕微鏡検査で観察しました。
β-グルクロニダーゼ（GUS）を用いた根の組織化学染色は、MalamiとBenfey36が記載したプロトコルに従って実施した。実生は90%アセトンで一晩固定し、GUS緩衝液中の0.5 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-d-グルクロン酸で1時間染色した後、水和クロルアルデヒド溶液（水和クロラール8g、水2ml、グリセロール1ml）に浸漬し、Axio Imager M1顕微鏡（Carl Zeiss社製）を用いて微分干渉顕微鏡で観察した。
垂直に置いたプレート上で生育した7日齢の苗の根の角度を測定しました。ステップ6で説明したように、重力ベクトルの方向から根の角度を測定します。
皮質微小管の配列は、プロトコル37に若干の修正を加えた上で、記載の通りに観察した。抗β-チューブリン抗体（KMX-1、Merk Millipore：MAB3408）およびAlexa Fluor 488標識抗マウスIgG（Thermo Fisher Scientific：A32723）を、それぞれ1:1000および1:100の希釈率で一次抗体および二次抗体として使用した。蛍光画像は、TCS SPE共焦点レーザー走査顕微鏡（Leica Microsystems）を用いて取得した。Zスタック画像を取得し、製造元の指示に従って最大強度投影図を作成した。
HeLa 細胞増殖アッセイは、Cell Counting Kit 8 (Dojindo) を使用して製造元の指示に従って実施しました。
大腸菌 DH5α の増殖は、分光光度計を使用して 600 nm (OD600) で培養中の細胞密度を測定することによって分析されました。
トランスジェニックBY-2細胞における細胞骨格構造は、CSU-X1共焦点走査装置（横河電機）とsCMOSカメラ（Zyla、Andor Technology）を備えた蛍光顕微鏡を用いて観察した。細胞骨格密度は、ImageJソフトウェアを用いて共焦点画像における細胞質ピクセルに対する細胞骨格ピクセルの割合を定量化し、38,39で報告されているように評価した。
BY-2細胞における細胞死を検出するため、細胞懸濁液の一部を0.05%エバンスブルーと共に室温で10分間インキュベートした。死細胞の選択的エバンスブルー染色は、生細胞からエバンスブルーが無傷の細胞膜から押し出されることで起こる40。染色された細胞は明視野顕微鏡（BX53、オリンパス社製）を用いて観察した。
HeLa細胞を10% FBS添加DMEM培地で培養し、加湿インキュベーター内で37℃、5% CO2で培養した。細胞を100 μM KAND 11、クマモナミック酸6、クマモナミド1、100 ng/ml コルセミド（Gibco）、または100 ng/ml Nocodmaze（Sigma）で37℃、6時間処理した。細胞をメタノールで10分間固定した後、室温で酢酸で5分間固定した。固定した細胞を0.5% BSA/PBSで希釈したβ-チューブリン一次抗体（1D4A4、Proteintech: 66240-1）で2時間インキュベートし、TBSTで3回洗浄した後、Alexa Fluorヤギ抗体で1時間インキュベートした。 – マウスIgG（Thermo Fisher Scientific: A11001）と15 ng/mlの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を0.5% BSA/PBSで希釈した。TBSTで3回洗浄した後、染色した細胞をNikon Eclipse Ti-E倒立顕微鏡で観察した。画像は、冷却式浜松ホトニクス製ORCA-R2 CCDカメラ（MetaMorphソフトウェア（Molecular Devices）を使用）で取得した。
投稿日時: 2024年6月17日