Nature.comにご訪問いただきありがとうございます。お使いのブラウザのバージョンはCSSのサポートが制限されています。最適な表示のためには、より新しいバージョンのブラウザをご利用いただくか、Internet Explorerの互換表示モードを無効にすることをお勧めします。当面の間、継続的なサポートを確保するため、スタイルシートやJavaScriptを適用せずにサイトを表示しております。
天然物の発見と有益な利用は、人間の生活を向上させるのに役立つ。植物成長阻害物質は、雑草防除のための除草剤として広く使用されている。様々な種類の除草剤を使用する必要性から、新しい作用機序を持つ化合物の特定が求められている。本研究では、Streptomyces werraensis MK493-CF1から新規N-アルコキシピロール化合物であるクマモノアミドを発見し、その完全な合成プロセスを確立した。生物活性アッセイを通じて、ウルスモノアミドの合成中間体であるウルスモノアミド酸と、潜在的な化合物を発見した。植物成長阻害物質さらに、我々は、HeLa細胞の増殖に悪影響を与えることなく高い除草活性を示すウルベニルオキシ誘導体（UDA）を含む、様々なウルベノン酸誘導体を開発しました。また、ウルベノン酸誘導体が植物の微小管を破壊すること、さらにKANDがアクチンフィラメントに影響を与え細胞死を誘導することも発見しました。これらの多面的な効果は、既知の微小管阻害剤の効果とは異なり、ウルソン酸の新たな作用機序を示唆しており、新規除草剤の開発において重要な利点となります。
有益な天然物とその誘導体の発見と実用化は、人間の生活の質を向上させる手段である。微生物、植物、昆虫によって生成される二次代謝産物は、医学と農業の大きな進歩につながった。多くの抗生物質や抗白血病薬は天然物から開発されている。さらに、さまざまなタイプの農薬殺菌剤や除草剤は、これらの天然物から抽出され、農業で使用されています。特に、雑草防除除剤は現代農業における作物収量増加のための重要なツールであり、すでに様々な種類の化合物が商業的に使用されています。光合成、アミノ酸代謝、細胞壁合成、有糸分裂の調節、植物ホルモンシグナル伝達、タンパク質合成など、植物のいくつかの細胞プロセスは、除草剤の典型的な標的と考えられています。微小管機能を阻害する化合物は、有糸分裂の調節に影響を与えることで植物の成長に影響を与える一般的な除草剤の一種です2。
微小管は細胞骨格の構成要素であり、真核細胞に広く保存されている。チューブリンヘテロ二量体はα-チューブリンとβ-チューブリンからなり、線状の微小管プロトフィラメントを形成し、13本のプロトフィラメントが円筒状構造を形成する。微小管は植物細胞において、細胞の形状決定、細胞分裂、細胞内輸送など、複数の役割を担っている3,4。植物細胞は、細胞間期の細胞膜の下に微小管を有しており、これらのいわゆる皮質微小管は、セルロース合成酵素複合体の調節を介してセルロースミクロフィブリルの組織化を制御していると考えられている4,5。根端の急速伸長領域に存在する根表皮細胞の皮質微小管は側方に位置し、セルロースミクロフィブリルはこれらの微小管に沿って細胞伸長の方向を制限し、異方性細胞伸長を促進する。したがって、微小管の機能は植物の形態と密接に関連している。チューブリンをコードする遺伝子のアミノ酸置換は、シロイヌナズナの皮質微小管アレイの歪みと左右どちらかの成長を引き起こします6,7。同様に、微小管ダイナミクスを制御する微小管関連タンパク質の変異も、根の成長の歪みにつながる可能性があります8,9,10,11,12,13。さらに、プレチラクロールとしても知られるジソピラミドなどの微小管破壊除草剤による処理も、左側の斜めの根の成長を引き起こします14。これらのデータは、微小管機能の精密な制御が植物の成長方向を決定する上で重要であることを示しています。
様々な種類の微小管阻害剤が発見されており、これらの薬剤は細胞骨格研究だけでなく、農業や医学にも大きく貢献している2。特に、オリザリン、ジニトロアニリン化合物、ジソピラミド、ベンズアミド関連化合物、およびそれらの類縁体は微小管の機能を阻害し、それによって植物の成長を阻害することができる。そのため、これらは除草剤として広く使用されている。しかし、微小管は植物細胞と動物細胞の重要な構成要素であるため、ほとんどの微小管阻害剤は両方の細胞種に対して細胞毒性を示す。したがって、除草剤としての有用性が認められているにもかかわらず、実用的な目的で使用されている抗微小管剤は限られている。
ストレプトマイセスは、好気性グラム陽性糸状細菌を含むストレプトマイセス科の属であり、幅広い二次代謝産物を産生する能力で広く知られています。そのため、新規生物活性天然物の最も重要な供給源の1つと考えられています。本研究では、Streptomyces werraensis MK493-CF1とS. werraensis ISP 5486から単離されたクモノアミドと呼ばれる新規化合物を発見しました。スペクトル分析と全スペクトル分析を使用して、クモノアミドの構造が特徴付けられ、そのユニークなN-アルコキシピロール骨格が決定されました。合成。ウルスモノアミドとその誘導体の合成中間体であるウルスモン酸は、一般的なモデル植物であるシロイヌナズナの成長と発芽を阻害することがわかりました。構造活性相関研究において、C9位をウルソン酸に修飾した化合物、すなわちウルソン酸ノニルオキシ誘導体（KAND）が、成長および発芽に対する阻害効果を著しく増強することを見出した。特筆すべきは、この新たに発見された植物成長阻害剤がタバコやゼニゴケの成長にも影響を与え、細菌やHeLa細胞に対して細胞毒性を示さなかったことである。さらに、一部のウルソン酸誘導体は根の形態異常を誘発し、これらの誘導体が微小管に直接的または間接的に影響を与えることを示唆している。この考えと一致して、免疫組織化学的または蛍光タンパク質で標識した微小管の観察結果は、KAND処理が微小管を脱重合させることを示している。加えて、クマモトニック酸誘導体による処理はアクチンミクロフィラメントを破壊した。このように、我々は細胞骨格の破壊を作用機序とする独自の作用機序を持つ新規植物成長阻害剤を発見した。
株MK493-CF1は、東京都品川区の土壌から分離された。株MK493-CF1は、よく分岐したストロマ菌糸を形成した。16SリボソームRNA遺伝子の部分配列（1422 bp）を決定した。この株はS. werraensis（NBRC 13404T = ISP 5486、1421/1422 bp、T：標準株、99.93%）と非常に類似していた。この結果に基づき、この株はS. werraensisのタイプ株と近縁であると判断された。したがって、この株を暫定的にS. werraensis MK493-CF1と命名した。S. werraensis ISP 5486Tも同じ生理活性物質を産生する。この微生物から天然物を得るための初期の研究はほとんどなかったため、さらなる化学研究を行った。 S. werraensis MK493-CF1を大麦培地で30℃、14日間固体培養した後、培地を50% EtOHで抽出した。60 mlのサンプルを乾燥させて、59.5 mgの粗抽出物を得た。この粗抽出物を逆相HPLCにかけ、N-メトキシ-1H-ピロール-2-カルボキサミド（1、クマモトアミドと命名、36.0 mg）を得た。1の総量は粗抽出物の約60%であった。そこで、クマモトアミド1の特性を詳細に研究することにした。
クマモンアミド1は白色の非晶質粉末であり、高分解能質量分析法（HRESIMS）によりC6H8N2O2であることが確認された（図1）。この化合物のC2置換ピロールフラグメントは、δH 6.94（1H、t、J = 2.8、4.8 Hz、H-4）、δH 6.78（1H、d、J = 2.5、1H NMRスペクトルのδH：4.5 Hz、H-5）、およびδH 6.78（1H、d、J = 2.5 Hz、H-6）によって特徴付けられ、13C NMRスペクトルは4つのsp2炭素原子の存在を示している。C2位にアミド基が存在することは、C-3プロトンからδC 161.1のアミドカルボニル炭素へのHMBC相関によって評価された。さらに、δH 4.10 (3H, S) および δC 68.3 の 1 H および 13 C NMR ピークは、分子内に N-メトキシ基が存在することを示している。メトキシ基の正確な位置は、差分分光法や核オーバーハウザー略記法 (NOEDF) などの分光分析によってまだ決定されていないが、N-メトキシ-1H-ピロール-2-カルボキサミドが最初の候補化合物となった。
1 の正しい構造を決定するために、全合成を行った (図 2a)。市販の 2-アミノピリジン 2 を m-CPBA で処理すると、対応する N-オキシド 3 が定量的収率で得られた。2 の 2-アミノアジド化後、Abramovich によって記載された環化縮合反応をベンゼン中で 90 °C で行い、目的の 1-ヒドロキシ-1H-ピロール-2-カルボニトリル 5 をグラム 60% の収率 (2 段階) で得た。15,16。次に 4 のメチル化と加水分解により、1-メトキシ-1H-ピロール-2-カルボン酸 (「クモトニック酸」、6 と呼ばれる) が良好な収率 (70%、2 段階) で得られた。最後に、酸塩化物中間体 6 を水性アンモニアでアミド化することにより、熊本アミド 1 が 98% の収率で得られた。合成された 1 のすべてのスペクトルデータは単離された 1 と類似していたため、1 の構造が決定された。
ウルベナミドおよびウルベン酸の一般的な合成と生物活性の分析。(a) 熊本アミドの全合成。(b) 7日齢の野生型シロイヌナズナColumbia (Col)実生を、指定された濃度のクマモナミド6またはクマモナミド1を含むMurashige and Skoog (MS)プレート上で栽培した。スケールバー = 1 cm。
まず、ウルベナミドとその中間体の植物成長を調節する能力について、その生物学的活性を評価しました。MS寒天培地に様々な濃度のウルスモナミド1またはウルスモン酸6を添加し、この培地でシロイヌナズナの苗を培養しました。これらのアッセイでは、6の高濃度（500 μM）が根の成長を阻害することが示されました（図2b）。次に、6のN1位を置換して様々な誘導体を生成し、それらについて構造活性相関研究を行いました（類似体の合成プロセスは補足情報（SI）に記載されています）。シロイヌナズナの苗を50 μMのウルソン酸誘導体を含む培地で育て、根の長さを測定しました。図に示されています。図3a、b、およびS1に示すように、クマモ酸はN1位に長さの異なる直鎖アルコキシ鎖（9、10、11、12、および13）または長いアルコキシ鎖（15、16、および17）を有しています。これらの誘導体は根の成長を著しく阻害しました。さらに、200 μMの10、11、または17を適用すると発芽が阻害されることがわかりました（図3cおよびS2）。
熊本アミドおよび関連化合物の構造活性相関の研究。(a) 類似体の構造と合成スキーム。(b) 50 μM クマモンアミド誘導体の有無にかかわらず MS 培地で生育させた 7 日齢実生の根長の定量。アスタリスクは、偽処理との有意差を示す (t 検定、p< 0.05)。n>18. データは平均値±標準偏差で示されています。ntは、種子の50%以上が発芽しなかったため「テストされていません」を意味します。(c) 200 μMのクマモナミドおよび関連化合物の有無にかかわらず、MS培地で7日間培養した処理済み種子の発芽率の定量化。アスタリスクは、偽処理との有意差を示します（カイ二乗検定）。n=96。
興味深いことに、C9よりも長いアルキル側鎖を付加すると阻害活性が低下したことから、クマモト酸関連化合物は生物活性を発揮するために一定の大きさの側鎖を必要とすることが示唆された。
構造活性相関分析により、C9がウルソン酸に修飾され、ウルソン酸のノニルオキシ誘導体（以下、KAND 11と呼ぶ）が最も効果的な植物成長阻害剤であることが示されたため、KAND 11のより詳細な特性評価を行った。シロイヌナズナを50 μMのKAND 11で処理すると、発芽がほぼ完全に阻害されたが、より低い濃度（40、30、20、または10 μM）のKAND 11は用量依存的に根の成長を阻害した（図4a、b）。KAND 11が根端分裂組織の生存率に影響を与えるかどうかを調べるために、ヨウ化プロピジウム（PI）で染色した根端分裂組織を調べ、分裂組織の面積サイズを測定した。 25 μM KAND-11 を含む培地で生育した実生の分裂組織のサイズは 151.1 ± 32.5 μm であったのに対し、DMSO を含む対照培地で生育した実生の分裂組織のサイズは 264.7 ± 30.8 μm であった (図 4c、d)。これは、KAND-11 が細胞増殖活性を回復させることを示している。
ウルベノン酸誘導体（ウルベニルオキシ誘導体）の成長阻害効果の解析。（a）KAND 11を指示された濃度で添加したMS培地で生育させた7日齢の野生型Col実生。スケールバー＝1cm。（b）根長の定量。文字は有意差を示す（Tukey HSD検定、p< 0.05)。n>16. データは平均値±標準偏差で示されています。(c) 25 μM KAND 11の有無にかかわらずMSプレート上で生育させたプロピジウムヨウジド染色した野生型Col根の共焦点顕微鏡像。白い括弧は根端分裂組織を示します。スケールバー = 100 µm。(d) 根端分裂組織サイズの定量化（n = 10～11）。統計的有意差はt検定（p（p < 0.05）。棒グラフは平均分裂組織サイズを表します。（e）CDKB2構築物を含む根端分裂組織の微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡像。1pro：CDKB2；1-GUS染色、および25 µM KANDアッセイの有無にかかわらずMSプレート上で生育した5日齢の実生の染色像。
KAND 11の植物毒性は、別の双子葉植物であるタバコ（Nicotiana tabacum）と、主要な陸上植物モデル生物であるゼニゴケ（Marchantia polymorpha）を用いてさらに試験された。シロイヌナズナの場合と同様に、25 μMのKAND 11を含む培地で生育させたタバコSR-1実生は、根が短くなった（図5a）。さらに、200 μMのKAND 11を含むプレートでは48個の種子のうち40個が発芽したが、モック処理した培地では48個すべてが発芽したことから、KANDの高濃度が有意であることが示された（pクマモノアミド 1、クマモノアミド酸 6、および KAND 11 は、100 μM の濃度で HeLa 細胞または E. coli 細胞の増殖を阻害しました (図 5b)。さらに、ゼニゴケで細菌の増殖を阻害した KAND 11 の濃度は、シロイヌナズナで有効濃度と類似していました (図 5c)。これらの結果は、KAND 11 がさまざまな植物の増殖を阻害できることを示しています。次に、クマモノアミド関連化合物の細胞毒性の可能性を、他の生物、すなわち高等動物細胞および細菌細胞の代表として、ヒト HeLa 細胞および大腸菌株 DH5α で調査しました。一連の細胞増殖アッセイで、クマモノアミド 1、クマモノアミド酸 6、および KAND 11 は、100 μM の濃度で HeLa 細胞または E. coli 細胞の増殖に影響を与えないことが観察されました (図 5d、e)。
非シロイヌナズナ生物における KAND 11 の増殖阻害。(a) 2 週間齢の野生型 SR-1 タバコ実生を、25 μM KAND 11 を含む垂直に配置された MS プレート上で栽培した。(b) 2 週間齢の野生型 SR-1 タバコ実生を、200 μM KAND 11 を含む水平に配置された MS プレート上で栽培した。(c) 2 週間齢の野生型 Tak-1 ゼニゴケ芽を、示された濃度の KAND 11 を含む Gamborg B5 プレート上で栽培した。赤い矢印は、2 週間の培養期間中に成長が停止した胞子を示す。(d) HeLa 細胞の細胞増殖アッセイ。細胞計数キット 8 (同仁化学研究所) を使用して、一定の時間間隔で生存細胞数を測定した。対照として、HeLa 細胞を 5 μg/ml のアクチノマイシン D (Act D) で処理した。Act D は RNA ポリメラーゼ転写を阻害し、細胞死を引き起こす。分析は3回繰り返して行った。(e) 大腸菌細胞増殖アッセイ。OD600を測定することにより大腸菌の増殖を分析した。対照として、細菌の細胞壁合成を阻害する50 μg/mlのアンピシリン（Amp）で細胞を処理した。分析は3回繰り返して行った。
ウラミド関連化合物によって引き起こされる細胞毒性の作用機序を解明するために、中程度の阻害効果を持つウルベン酸誘導体を再分析しました。図に示すように、図2b、6aに示すように、高濃度（200 μM）のウルモトニック酸6を含む寒天プレートで生育した実生は、より短く左に湾曲した根（θ = – 23.7 ± 6.1）を形成しましたが、対照培地で生育した実生は、ほぼまっすぐな根（θ = – 3.8 ± 7.1）を形成しました。この特徴的な斜めの成長は、皮質微小管の機能不全に起因することが知られています14,18。この発見と一致して、微小管不安定化薬であるジソピラミドとオリザリンは、我々の生育条件下で同様の根の傾斜を誘発しました（図2b、6a）。同時に、ウルモトニック酸誘導体を試験し、特定の濃度で斜めの根の成長を誘導するいくつかの化合物を選択した。化合物8、9、15は、それぞれ75 μM、50 μM、40 μMで根の成長方向を変え、これらの化合物が微小管を効果的に不安定化できることを示した（図2b、6a）。また、最も強力なウルソール酸誘導体であるKAND 11をより低い濃度（15 µM）で試験したところ、KAND 11の適用により根の成長が阻害され、根の成長方向は不均一であったが、左に傾く傾向があった（図C3）。微小管不安定化薬の濃度が高いと、根の傾斜を引き起こすのではなく、植物の成長を阻害することがあるから、その後、根の表皮細胞の皮質微小管を観察することにより、KAND 11が微小管に影響を与える可能性を評価した。 25 μMのKAND 11で処理した実生根の表皮細胞を抗β-チューブリン抗体で免疫組織化学的に調べたところ、伸長帯の表皮細胞において皮質微小管がほぼすべて消失していることが示された（図6b）。これらの結果は、クマモトニック酸とその誘導体が微小管に直接的または間接的に作用して微小管を破壊すること、そしてこれらの化合物が新規の微小管阻害剤であることを示している。
ウルソン酸とその誘導体は、シロイヌナズナの皮質微小管を変化させる。(a) 様々なウルソン酸誘導体を指示された濃度で添加した際の根の傾斜角を測定した。微小管を阻害することが知られている2つの化合物、ジソピラミドとオリザリンの影響も分析した。挿入図は、根の成長角度を測定するために使用した標準を示す。アスタリスクは、偽処理との有意差を示す（t検定、p< 0.05)。n>19. スケールバー = 1 cm。(b) 伸長帯の表皮細胞における皮質微小管。25 μM KAND 11 の有無にかかわらず MS プレート上で生育させた野生型シロイヌナズナ Col 根の微小管を、β-チューブリン一次抗体と Alexa Fluor 標識二次抗体を用いた免疫組織化学染色により可視化した。スケールバー = 10 µm。(c) 根端分裂組織における微小管の有糸分裂構造。微小管は免疫組織化学染色により可視化した。前期帯、紡錘体、フラグモプラストなどの有糸分裂構造を共焦点画像からカウントした。矢印は有糸分裂微小管構造を示す。アスタリスクは、偽処理との有意差を示す (t 検定、p< 0.05)。n>9. スケールバー = 50 µm。
Ursaは微小管機能を阻害する能力を持つが、その作用機序は典型的な微小管脱重合剤とは異なると考えられる。例えば、ジソピラミドやオリザリンなどの高濃度の微小管脱重合剤は表皮細胞の異方性膨張を誘導するが、KAND 11は誘導しない。さらに、KAND 11とジソピラミドを同時適用すると、ジソピラミド誘導の根の成長反応とKAND 11誘導の成長阻害が同時に観察された（図S4）。我々はまた、ジソピラミド過敏性変異体1-1（phs1-1）のKAND 11に対する反応も解析した。phs1-1は非典型的なチューブリンキナーゼ点変異を持ち、ジソピラミド処理により根が短くなる9,20。 KAND 11を含む寒天培地で生育したphs1-1変異体実生は、ジソピラミッドで生育したものと同様に根が短かった（図S5）。
さらに、KAND 11で処理した実生の根端分裂組織では、前期帯、紡錘体、フラグモプラストなどの有糸分裂微小管構造が観察された。CDKB2;1p::CDKB2;1-GUSの観察結果と一致して、有糸分裂微小管の数が有意に減少していることが観察された（図6c）。
KAND 11の細胞毒性を細胞内レベルで特徴づけるため、タバコBY-2懸濁細胞をKAND 11で処理し、その反応を観察した。まず、微小管を蛍光標識するTagRFP-TUA6を発現するBY-2細胞にKAND 11を添加し、皮質微小管に対するKAND 11の効果を評価した。皮質微小管密度は、細胞質ピクセルに対する細胞骨格ピクセルの割合を定量化する画像解析を用いて評価した。アッセイの結果、50 μMまたは100 μMのKAND 11で1時間処理した後、密度はそれぞれ0.94 ± 0.74%または0.23 ± 0.28%に有意に減少したが、DMSOで処理した細胞の密度は1.61 ± 0.34%であった（図7a）。これらの結果は、KAND 11 処理が皮質微小管の脱重合を誘導するというシロイヌナズナの観察と一致しています (図 6b)。また、同じ濃度の KAND 11 で処理した後の GFP-ABD 標識アクチンフィラメントを持つ BY-2 株を調べ、KAND 11 処理がアクチンフィラメントを破壊することを観察しました。50 μM または 100 μM の KAND 11 で 1 時間処理すると、アクチンフィラメント密度はそれぞれ 1.20 ± 0.62% または 0.61 ± 0.26% に有意に減少しましたが、DMSO 処理した細胞の密度は 1.69 ± 0.51% でした (図 2)。7b)。これらの結果は、アクチンフィラメントに影響を与えないプロピザミドや、微小管に影響を与えないアクチン脱重合剤であるラトルンクリン B の効果とは対照的です (SI 図 S6)。さらに、クマモナミド1、クマモナミド酸6、またはKAND 11による処理はHeLa細胞の微小管に影響を与えなかった（SI図S7）。したがって、KAND 11の作用機序は既知の細胞骨格破壊剤とは異なると考えられる。また、KAND 11で処理したBY-2細胞の顕微鏡観察では、KAND 11処理中に細胞死が始まることが明らかになり、KAND 11処理30分後にはエバンスブルー染色された死細胞の割合は有意に増加しなかったが、50 μMまたは100 μMのKANDで90分処理すると、死細胞数はそれぞれ43.7%または80.1%に増加した（図7c）。これらのデータを総合すると、新規ウルソール酸誘導体KAND 11は、これまで知られていなかった作用機序を持つ植物特異的な細胞骨格阻害剤であることが示唆される。
KANDはタバコBY-2細胞の皮質微小管、アクチンフィラメント、および生存率に影響を与える。(a) TagRFP-TUA6存在下でのBY-2細胞の皮質微小管の可視化。KAND 11（50 μMまたは100 μM）またはDMSOで処理したBY-2細胞を共焦点顕微鏡で観察した。皮質微小管密度は、25個の独立した細胞の顕微鏡写真から計算した。文字は有意差を示す（Tukey HSD検定、p（p < 0.05）。スケールバー = 10 µm。（b）GFP-ABD2存在下で可視化されたBY-2細胞の皮質アクチンフィラメント。KAND 11（50 μMまたは100 μM）またはDMSOで処理したBY-2細胞を共焦点顕微鏡で観察した。皮質アクチンフィラメントの密度は、25個の独立した細胞の顕微鏡写真から計算した。文字は有意差を示す（Tukey HSD検定、p < 0.05）。(c) エバンスブルー染色によるBY-2細胞の死細胞の観察。KAND 11 (50 μMまたは100 μM)またはDMSOで処理したBY-2細胞を明視野顕微鏡で観察した。n=3。スケールバー=100 µm。
新規天然物の発見と応用は、医学や農業を含む人間の生活のさまざまな側面で大きな進歩をもたらしました。歴史的に、天然資源から有用な化合物を得るための研究が行われてきました。特に、放線菌は、イベルメクチンのリード化合物であるアベルメクチンや、抗がん剤として医学的に使用されているブレオマイシンとその誘導体など、さまざまな二次代謝産物を生成する能力があるため、線虫に対する抗寄生虫抗生物質として有用であることが知られています21,22。同様に、放線菌からさまざまな除草化合物が発見されており、その一部はすでに商業的に使用されています1,23。したがって、望ましい生物活性を持つ天然物を単離するために放線菌の代謝産物を分析することは、効果的な戦略と考えられています。本研究では、S. werraensisから新しい化合物であるクマモンアミドを発見し、その合成に成功しました。ウルソン酸は、ウルベナミドとその誘導体の合成中間体です。ウルモトニック酸は、特徴的な根の巻き込みを引き起こし、中程度から強い除草活性を示し、植物の微小管を直接的または間接的に損傷する。しかし、KAND 11はアクチンフィラメントも破壊し、細胞死を引き起こすことから、ウルモトニック酸とその誘導体が幅広い細胞骨格構造に影響を与える調節機構が存在することが示唆され、ウルモトニック酸の作用機序は既存の微小管阻害剤とは異なる可能性がある。
ウルベノン酸の詳細な特性解析は、ウルベノン酸の作用機序の理解を深めるのに役立つだろう。特に、次の目標は、ウルソン酸が還元型微小管に結合する能力を評価し、ウルソン酸とその誘導体が微小管に直接作用して脱重合させるのか、あるいは微小管の不安定化を引き起こすのかを明らかにすることである。さらに、微小管が直接の標的でない場合、植物細胞におけるウルソン酸の作用部位と分子標的を特定することで、関連化合物の特性や除草活性を向上させる可能性のある方法をより深く理解するのに役立つだろう。我々の生物活性試験では、ウルソン酸がシロイヌナズナ、タバコ、ゼニゴケなどの植物の成長に対して特異的な細胞毒性を示すことが明らかになったが、大腸菌やHeLa細胞には影響が見られなかった。動物細胞に対する毒性がほとんどない、あるいは全くないことは、ウルソン酸誘導体が露地栽培の農地で使用する除草剤として開発される場合の利点となる。実際、微小管は真核生物に共通する構造であるため、植物における微小管の選択的阻害は除草剤にとって重要な要件である。例えば、チューブリンに直接結合して重合を阻害する微小管脱重合剤であるプロピザミドは、動物細胞に対する毒性が低いため除草剤として使用されている24。ジソピラミドとは対照的に、関連するベンズアミドは異なる標的特異性を持つ。RH-4032またはベンゾキサミドは、植物の微小管に加えて、それぞれ動物細胞または卵菌の微小管も阻害し、ザリラミドは植物毒性が低いため殺菌剤として使用されている25,26,27。新たに発見されたベアとその誘導体は植物に対して選択的な細胞毒性を示すが、さらなる修飾によって標的特異性が変化し、病原性真菌または卵菌の制御のための追加の誘導体が得られる可能性があることに留意する価値がある。
ウルベノン酸とその誘導体の特異な性質は、除草剤としての開発や研究ツールとしての利用に有用である。植物細胞の形状制御における細胞骨格の重要性は広く認識されている。これまでの研究では、植物は形態形成を適切に制御するために微小管ダイナミクスを制御することで、皮質微小管組織の複雑なメカニズムを進化させてきたことが示されている。微小管活性の調節に関与する多数の分子が特定されており、関連する研究は現在も進行中である3,4,28。植物細胞における微小管ダイナミクスに関する現在の理解は、皮質微小管組織のメカニズムを完全に説明するものではない。例えば、ジソピラミドとオリザリンはどちらも微小管を脱重合させることができるが、ジソピラミドは深刻な根の変形を引き起こすのに対し、オリザリンは比較的軽微な影響しか与えない。さらに、微小管を安定化させるチューブリンの変異は根の右旋回転も引き起こすが、微小管ダイナミクスを安定化させるパクリタキセルは引き起こさない。したがって、ウルソール酸の分子標的を研究し特定することで、植物皮質微小管の制御に関する新たな知見が得られるはずである。同様に、ジソピラミドのように異常成長を促進する効果の高い化学物質と、オリザリンやクマモトリン酸のように効果の低い化学物質を将来的に比較することで、異常成長がどのように起こるのかの手がかりが得られるだろう。
一方、ウルソン酸の細胞毒性を説明するもう一つの可能性として、防御に関連した細胞骨格の再編成が挙げられます。病原体の感染やエリシターの植物細胞への導入は、時に細胞骨格の破壊とそれに続く細胞死を引き起こします29。例えば、卵菌由来のクリプトキサンチンは、タバコ細胞死の前に微小管とアクチンフィラメントを破壊することが報告されており、これはKAND処理で起こることと同様です30,31。防御応答とウルソン酸によって誘導される細胞応答の類似性から、両者が共通の細胞プロセスを引き起こすという仮説を立てましたが、ウルソン酸はクリプトキサンチンよりも速く強力な効果を発揮することは明らかです。しかし、アクチンフィラメントの破壊は自発的な細胞死を促進し、必ずしも微小管の破壊を伴うとは限らないことが研究で示されています29。さらに、ウルソン酸誘導体のように、病原体またはエリシターが根の成長異常を引き起こすかどうかはまだ明らかになっていません。したがって、防御応答と細胞骨格を結びつける分子レベルの知見は、取り組むべき魅力的な課題である。ウルソン酸に関連する低分子量化合物、および様々な効力を持つ誘導体の存在を利用することで、未知の細胞メカニズムを標的とする機会が得られる可能性がある。
総合的に見ると、微小管の動態を調節する新規化合物の発見と応用は、植物細胞の形状決定の根底にある複雑な分子メカニズムを解明するための強力な手段となるだろう。この点において、微小管とアクチンフィラメントに作用し、細胞死を誘導する最近開発された化合物ウルベノン酸は、微小管制御とこれらの他のメカニズムとの関連性を解明する機会を提供する可能性がある。したがって、ウルベノン酸を用いた化学的および生物学的分析は、植物細胞骨格を制御する分子調節メカニズムの理解に役立つだろう。
S. werraensis MK493-CF1 を、脱イオン水に 2% (w/v) ガラクトース、2% (w/v) エッセンスペースト、1% (w/v) バクト組成物 -大豆 (Thermo Fisher Scientific, Inc.)、0.5% (w/v) トウモロコシ抽出物 (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan)、0.2% (w/v) (NH4)2SO4 および 0.2% CaCO3 を溶解した 110 mL のシード培地が入った 500 mL バッフル付き三角フラスコに接種します (滅菌前の pH 7.4)。シード培養は、27 °C で 2 日間、回転振とう機 (180 rpm) でインキュベートしました。固体発酵による生産培養。種培養液（7 ml）を、圧搾大麦（MUSO株式会社、日本）15 gと脱イオン水（滅菌前にpH調整なし）25 gからなる生産培地40 gを含む500 ml K-1フラスコに移した。発酵は30℃で暗所にて14日間行った。発酵物を40 ml/ボトルのエタノールで抽出し、遠心分離（1500 g、4℃、10分）した。培養上清（60 ml）を10% MeOH/EtOAc混合液で抽出した。有機層を減圧下で蒸発させて残留物（59.5 mg）を得た。これを逆相カラム（SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120、5 μm、ID 10 mm × 長さ 250 mm）を用いて、流速 1.5 ml/min でグラジエント溶出（0～10 分：90% H2O/CH3CN、10～35 分：90% H2O/CH3CN から 70% H2O/CH3CN（グラジエント）、35～45 分：90% H2O/EtOH、45～155 分：90% H2O/EtOH から 100% EtOH（グラジエント（グラジエント）、155～200 分：100% EtOH）によるHPLCに供し、クマーモンアミド（1、36.0 mg）を白色非晶質粉末として単離した。
熊本アミド(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz, 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ 計算値: 141.0659、測定値: 141.0663、IR νmax 3451、3414、3173、2938、1603、1593、1537 cm–1。
コロンビア種子（Col-0）は、研究用として許可を得てアラビドプシス生物資源センター（ABRC）から入手した。Col-0種子は、当研究室の条件下で増殖および維持され、野生型アラビドプシス植物として使用された。アラビドプシス種子は表面殺菌され、2%スクロース（富士フイルム和光純薬）、0.05%（w/v）2-（4-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）（富士フイルム和光純薬）、および1.5%寒天（富士フイルム和光純薬）、pH 5.7を含む半濃度のムラシゲ・スクーグ培地で、23℃、連続光下で培養された。phs1-1変異体の種子は、T. Hashimoto（奈良先端科学技術大学院大学）から提供された。
SR-1系統の種子は、T. Hashimoto氏（奈良先端科学技術大学院大学）から提供され、野生型タバコ植物として使用した。タバコの種子は表面殺菌後、発芽を促進するために滅菌水に3晩浸漬し、その後、2%スクロース、0.05%（w/v）MES、および0.8%ジェランガム（富士フイルム和光純薬）を含む半濃度のムラシゲ・スクーグ培地（pH 5.7）に入れ、23℃で常時光下で培養した。
Tak-1株は京都大学の甲地孝氏より提供され、苔類研究の標準実験単位として使用された。無菌培養植物から芽を採取し、1%ショ糖と0.3%ジェランガムを含むガンボルグB5培地（富士フイルム和光純薬）に塗布し、23℃で連続光照射下で培養した。
タバコBY-2細胞（Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2）は、S. Hasezawa（東京大学）より提供された。BY-2細胞は、改変Linsmeier and Skoog培地で95倍に希釈し、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸32を毎週添加した。細胞懸濁液は、27℃で暗所にて130 rpmの回転式振とう機で混合した。細胞を10倍量の新鮮な培地で洗浄し、同じ培地に再懸濁した。カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの下で微小管マーカーTagRFP-TUA6またはアクチンフィラメントマーカーGFP-ABD2を安定的に発現するBY-2形質転換細胞株は、既報33,34,35に従って作製した。これらの細胞株は、元のBY-2細胞株に使用した手順と同様の手順で維持および同期させることができる。
HeLa細胞は、10%ウシ胎児血清、1.2 U/mlペニシリン、および1.2 μg/mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（ライフテクノロジーズ）中で、5% CO2を含む37℃のインキュベーターで培養した。
本稿に記載されているすべての実験は、日本のバイオセーフティ規制およびガイドラインに従って実施されました。
化合物はジメチルスルホキシド（DMSO；富士フイルム和光純薬）に溶解してストック溶液とし、シロイヌナズナとタバコにはMS培地、ゼニゴケにはガンボルグB5培地で希釈した。根の成長阻害アッセイでは、1プレートあたり10個以上の種子を、指定された化合物またはDMSOを含む寒天培地に播種した。種子は7日間、生育チャンバーで培養した。実生を撮影し、根の長さを測定した。シロイヌナズナの発芽アッセイでは、1プレートあたり48個の種子を、200 μMの化合物またはDMSOを含む寒天培地に播種した。シロイヌナズナの種子は生育チャンバーで育て、発芽後7日目（dag）に発芽した実生の数を数えた。タバコの発芽アッセイでは、1プレートあたり24個の種子を、200 μMのKANDまたはDMSOを含む寒天培地に播種した。タバコの種子は生育チャンバーで育て、14日後に発芽した実生の数を数えた。ゼニゴケの成長阻害アッセイでは、各プレートから9個の胚を、指定された濃度のKANDまたはDMSOを含む寒天培地に播種し、成長チャンバー内で14日間培養した。
根端分裂組織の構造を可視化するために、5 mg/mlのヨウ化プロピジウム（PI）で染色した実生を用いた。PIシグナルは、TCS SPE共焦点レーザー走査顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社製）を用いた蛍光顕微鏡観察により確認した。
β-グルクロニダーゼ（GUS）による根の組織化学的染色法は、MalamiとBenfey36によって記載されたプロトコルに従って実施した。実生を90%アセトンで一晩固定し、GUSバッファー中の0.5 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-d-グルクロン酸で1時間染色した後、水和クロラール溶液（8 gのクロラール水和物、2 mlの水、1 mlのグリセロール）に入れ、Axio Imager M1顕微鏡（Carl Zeiss）を用いて微分干渉コントラスト顕微鏡で観察した。
垂直に設置したプレート上で生育させた7日齢の苗の根の角度を測定した。ステップ6で説明したように、重力ベクトルの方向に対する根の角度を測定する。
皮質微小管の配置は、プロトコル37に若干の変更を加えた上で、記載されているように観察した。抗β-チューブリン抗体（KMX-1、メルクミリポア：MAB3408）とAlexa Fluor 488標識抗マウスIgG（サーモフィッシャーサイエンティフィック：A32723）をそれぞれ1:1000および1:100の希釈率で一次抗体および二次抗体として使用した。蛍光画像は、TCS SPE共焦点レーザー走査顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を使用して取得した。製造元の指示に従ってZスタック画像を取得し、最大強度投影を作成した。
HeLa細胞増殖アッセイは、製造元の指示に従ってCell Counting Kit 8（同仁化学研究所製）を用いて実施した。
大腸菌DH5αの増殖は、分光光度計を用いて600 nm（OD600）で培養液中の細胞密度を測定することにより分析した。
トランスジェニックBY-2細胞の細胞骨格構造は、CSU-X1共焦点走査装置（横河電機製）とsCMOSカメラ（Zyla、Andor Technology社製）を備えた蛍光顕微鏡を用いて観察した。細胞骨格密度は画像解析により評価し、ImageJソフトウェアを用いて共焦点画像中の細胞質ピクセルに対する細胞骨格ピクセルの割合を定量化した（38,39参照）。
BY-2細胞の細胞死を検出するために、細胞懸濁液の一部を0.05%エバンスブルー溶液に室温で10分間浸漬した。死細胞の選択的なエバンスブルー染色は、無傷の細胞膜による生細胞からの色素の排出に依存する40。染色された細胞は明視野顕微鏡（BX53、オリンパス）を用いて観察した。
HeLa細胞は、10% FBSを添加したDMEM培地で、37℃、5% CO2の加湿インキュベーター内で培養した。細胞を100 μM KAND 11、クマモナム酸6、クマモナミド1、100 ng/mlコルセミド（Gibco）、または100 ng/mlノコドメイズ（Sigma）で37℃で6時間処理した。細胞を室温で10分間MetOHで固定し、次に5分間酢酸で固定した。固定した細胞を0.5% BSA/PBSで希釈したβ-チューブリン一次抗体（1D4A4、Proteintech：66240-1）で2時間インキュベートし、TBSTで3回洗浄した後、Alexa Fluorヤギ抗体で1時間インキュベートした。 – マウスIgG（Thermo Fisher Scientific: A11001）と15 ng/mlの4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を0.5% BSA/PBSで希釈した。TBSTで3回洗浄後、染色された細胞をNikon Eclipse Ti-E倒立顕微鏡で観察した。画像は、MetaMorphソフトウェア（Molecular Devices）を使用して、冷却式浜松ホトニクスORCA-R2 CCDカメラで撮影した。
投稿日時：2024年6月17日
