マツ線虫は、マツ林生態系に深刻な経済的損失をもたらすことが知られている検疫移動性内部寄生虫である。本研究では、ハロゲン化インドールのマツ線虫に対する殺線虫活性とその作用機序について概説する。5-ヨードインドールとアベルメクチン（陽性対照）のマツ線虫に対する殺線虫活性は、低濃度（10 μg/mL）で同等かつ高い活性を示した。5-ヨードインドールは、繁殖力、生殖活動、胚および幼虫の死亡率、そして運動行動を低下させた。無脊椎動物特異的グルタミン酸依存性塩素イオンチャネル受容体とリガンドとの分子相互作用は、5-ヨードインドールがアベルメクチンと同様に受容体の活性部位に強く結合するという考えを裏付けている。 5-ヨードインドールは線虫において、異常な器官の虚脱／収縮や液胞化の増加など、様々な表現型の変形を引き起こした。これらの結果は、液胞が線虫のメチル化を介した死に関与している可能性を示唆している。重要な点として、5-ヨードインドールはキャベツとダイコンの両植物種に対して無毒性であった。したがって、本研究は、環境条件下でのヨードインドールの施用がマツ枯れ被害を抑制できることを実証している。
マツノザイセンチュウ（Bursaphelenchus xylophilus）はマツノザイセンチュウ（PWN）に属し、マツ林の生態系に深刻な生態学的損害を与えることが知られている移動性内部寄生性線虫です1。マツノザイセンチュウが引き起こすマツ枯れ病（PWD）は、アジアやヨーロッパを含むいくつかの大陸で深刻な問題になりつつあり、北米では、この線虫が外来種のマツを枯死させます1,2。マツの衰退は大きな経済問題であり、その世界的な蔓延の見通しが憂慮されています3。以下のマツの種が、この線虫に最もよく襲われます：アカマツ、ヨーロッパマツ、クロマツ、チョウセンマツ、クロマツ、クロマツ、およびラジアータマツ4。マツノザイセンチュウは深刻な病気で、感染後数週間から数ヶ月以内にマツの木を枯死させることがあります。さらに、マツ線虫の発生はさまざまな生態系で一般的であるため、持続的な感染連鎖が確立されています1。
マツノザイセンチュウ（Bursaphelenchus xylophilus）は、マツノザイセンチュウ上科（Aphelenchoidea）102.5系統に属する検疫植物寄生性線虫です。この線虫は菌類を餌とし、マツの木材組織内で繁殖し、L1、L2、L3、L4の4つの幼虫期と成虫期に成長します1,6。食糧不足の状況下では、マツノザイセンチュウは特殊な幼虫期（ダウアー期）に移行し、媒介生物であるマツノマダラカミキリ（Monochamus alternatus）に寄生して健康なマツに感染します。健康な宿主では、線虫は植物組織内を急速に移動し、柔組織細胞を餌とするため、感染後1年以内に様々な過敏反応、マツの萎凋、そして枯死を引き起こします1,7,8。
マツノマダラカミキリの生物学的防除は長年の課題であり、検疫措置は20世紀にまで遡ります。現在のマツノマダラカミキリ防除戦略は、主に木材燻蒸や樹幹への線虫駆除剤の埋め込みといった化学処理です。最も一般的に使用されている線虫駆除剤は、アベルメクチンとアベルメクチン安息香酸塩で、これらはアベルメクチン系に属します。これらの高価な化学物質は、多くの線虫種に対して高い効果を示し、環境的に安全であると考えられています9。しかし、これらの殺線虫剤を繰り返し使用すると、選択圧が生じ、耐性を持つマツノザイセンチュウの出現につながることがほぼ確実です。これは、マツノザイセンチュウ（Leptinotarsa decemlineata）、コナガ（Plutella xylostella）、そして線虫のTrichostrongylus colubriformisおよびOstertagia circumcinctaなど、いくつかの害虫で実証されており、これらの害虫は徐々にアベルメクチン耐性を獲得しています10,11,12。したがって、PVDを制御するための代替手段、費用対効果が高く環境に優しい方法を見つけるには、耐性パターンを定期的に研究し、殺線虫剤を継続的にスクリーニングする必要があります。ここ数十年で、多くの研究者が線虫防除剤として植物抽出物、精油、揮発性物質の使用を提案しています13,14,15,16。
我々は最近、Caenorhabditis elegans 17 において細胞間および界間シグナル伝達分子であるインドールの殺線虫活性を実証した。インドールは微生物生態学において広く細胞内シグナル伝達に関与しており、微生物の生理、胞子形成、プラスミド安定性、薬剤耐性、バイオフィルム形成、毒性など、数多くの機能を制御している 18, 19 。インドールおよびその誘導体の他の病原性線虫に対する活性は研究されていない。本研究では、マツノザイセンチュウに対する34種のインドールの殺線虫活性を調査し、顕微鏡観察、タイムラプス撮影、分子ドッキング実験を用いて最も強力な5-ヨードインドールの作用機序を解明し、種子発芽試験を用いて植物に対する毒性効果を評価した。
高濃度（＞1.0 mM）のインドールは線虫に対して殺線虫効果があることが以前に報告されている17。B. xylophilus（混合ライフステージ）を1 mMのインドールまたは33種類のインドール誘導体で処理した後、対照群と処理群の生線虫と死亡線虫を計数することによりB. xylophilusの死亡率を測定した。5種類のインドールが顕著な殺線虫活性を示した。未処理の対照群の24時間後の生存率は95 ± 7%であった。試験した34種類のインドールのうち、1 mMの5-ヨードインドールと4-フルオロインドールは100%の死亡率を引き起こしたのに対し、5,6-ジフルオロインジゴ、メチルインドール-7-カルボキシレート、および7-ヨードインドールは約50%の死亡率を引き起こした（表1）。
5-ヨードインドールがマツノザイセンチュウの液胞形成および代謝に及ぼす影響。(A) アベルメクチンおよび5-ヨードインドールの成虫雄線虫への影響、(B) L1期の線虫卵、および(C) B. xylophilusの代謝。(i) 0時間では液胞は観察されなかったが、処理により(ii) 液胞、(iii) 複数の液胞の蓄積、(iv) 液胞の膨化、(v) 液胞の融合、および(vi) 巨大液胞の形成が認められた。赤矢印は液胞の膨化、青矢印は液胞の融合、黒矢印は巨大液胞を示す。スケールバー = 50 μm。
さらに、この研究では、マツ線虫におけるメタン誘発性死の連続プロセスも説明しました (図 4C)。メタン生成死は、非アポトーシス型の細胞死であり、顕著な細胞質液胞の蓄積に関連しています27。マツ線虫で観察された形態学的欠陥は、メタン誘発性死のメカニズムに密接に関連していると思われます。異なる時間での顕微鏡的検査により、5-ヨードインドール (0.1 mM) への 20 時間曝露後に巨大な液胞が形成されたことが確認されました。処理後 8 時間後には顕微鏡的液胞が観察され、12 時間後にはその数が増加しました。14 時間後にはいくつかの大きな液胞が観察されました。処理後 12～16 時間後には、いくつかの融合した液胞が明瞭に見え、液胞融合がメタン生成死のメカニズムの基礎であることを示しました。20 時間後、線虫全体でいくつかの巨大な液胞が見つかりました
5-ヨードインドールを投与した線虫では、液胞の凝集と破裂も観察された（図5）。これは、線虫の屈曲と液胞の環境への放出によって証明された。卵殻膜においても液胞の破壊が観察されたが、卵殻膜は通常は孵化時にL2によって無傷のまま保存されている（補足図S2）。これらの観察結果は、液胞形成および化膿の過程において、体液貯留と浸透圧調節不全、そして可逆的な細胞傷害（RCI）が関与していることを示唆している（図5）。
観察された液胞形成におけるヨウ素の役割を仮説として、ヨウ化ナトリウム（NaI）とヨウ化カリウム（KI）の殺線虫活性を調査しました。しかし、濃度（0.1、0.5、または1 mM）では、線虫の生存または液胞形成のいずれにも影響を及ぼしませんでした（補足図S5）。ただし、1 mM KIにはわずかな殺線虫効果がありました。一方、7-ヨードインドール（1または2 mM）は、5-ヨードインドールと同様に、複数の液胞と構造変形を誘発しました（補足図S6）。2つのヨードインドールはマツ線虫において同様の表現型特性を示しましたが、NaIとKIは示しませんでした。興味深いことに、インドールは試験した濃度ではB. xylophilusにおいて液胞形成を誘発しませんでした（データ未掲載）。したがって、結果により、インドール-ヨウ素複合体がB. xylophilusの液胞形成と代謝に関与していることが確認されました。
殺線虫活性試験を行ったインドール類の中で、5-ヨードインドールの滑り指数は-5.89 kcal/molと最も高く、次いで7-ヨードインドール（-4.48 kcal/mol）、4-フルオロインドール（-4.33）、インドール（-4.03）の順であった（図6）。5-ヨードインドールはロイシン218と強力な主鎖水素結合を形成し、その結合を安定化させる一方、他のインドール誘導体は側鎖水素結合を介してセリン260に結合する。モデル化された他のヨードインドールの中で、2-ヨードインドールは -5.248 kcal/mol の結合値を持ちます。これは、ロイシン 218 との主な水素結合によるものです。その他の既知の結合には、3-ヨードインドール (-4.3 kcal/mol)、4-ヨードインドール (-4.0 kcal/mol)、および 6-フルオロインドール (-2.6 kcal/mol) があります (補足図 S8)。 5-ヨードインドールと2-ヨードインドールを除くほとんどのハロゲン化インドールおよびインドール自体は、セリン260と結合する。イベルメクチンで観察されたように、ロイシン218との水素結合が効率的な受容体-リガンド結合を示しているという事実（補足図S7）は、5-ヨードインドールと2-ヨードインドールがイベルメクチンと同様に、ロイシン218を介してGluCL受容体の活性部位に強く結合することを裏付けている（図6および補足図S8）。我々は、この結合がGluCL複合体の開いた細孔構造を維持するために必要であり、5-ヨードインドール、2-ヨードインドール、アバーメクチン、およびイベルメクチンがGluCL受容体の活性部位に強く結合することにより、イオンチャネルを開いたままにして液体の取り込みを可能にしているのではないかと提案する。
インドールおよびハロゲン化インドールのGluCLへの分子ドッキング。(A)インドール、(B)4-フルオロインドール、(C)7-ヨードインドール、(D)5-ヨードインドールリガンドのGluCL活性部位への結合方向。タンパク質はリボンで示され、骨格の水素結合は黄色の点線で示されている。(A′)、(B′)、(C′)、(D′)は、対応するリガンドと周囲のアミノ酸残基との相互作用を示し、側鎖の水素結合はピンクの点線矢印で示されている。
5-ヨードインドールがキャベツおよび大根の種子の発芽に及ぼす毒性効果を評価する実験が行われた。5-ヨードインドール（0.05 mMまたは0.1 mM）またはアベルメクチン（10 μg/mL）は、初期の発芽および幼植物の出現にほとんど影響を与えなかった（図7）。さらに、未処理の対照群と5-ヨードインドールまたはアベルメクチンで処理した種子の発芽率に有意差は認められなかった。主根の伸長および形成された側根の数への影響は有意ではなかったが、1 mM（有効濃度の10倍）の5-ヨードインドールは側根の発達をわずかに遅らせた。これらの結果は、5-ヨードインドールが植物細胞に対して無毒であり、研究された濃度では植物の発育過程を妨げないことを示す。
5-ヨードインドールが種子発芽に及ぼす影響。B. oleraceaおよびR. raphanistrumの種子を、アベルメクチンまたは5-ヨードインドール添加または無添加のMurashige-Skoog寒天培地で発芽、萌芽、および側根発芽させた。発芽は22℃で3日間培養した後に記録した。
本研究では、インドールによる線虫の殺虫例が複数報告されている。重要なのは、ヨードインドールが松葉においてメチル化（小さな液胞が蓄積し、徐々に巨大な液胞へと融合し、最終的に膜破裂と死に至る過程）を誘導するという初めての報告であり、ヨードインドールは市販の殺線虫剤アベルメクチンと同様の顕著な殺線虫作用を示すことである。
インドールは、原核生物および真核生物において、バイオフィルムの阻害／形成、細菌の生存、病原性など、複数のシグナル伝達機能を発揮することが報告されている19,32,33,34。近年、ハロゲン化インドール、インドールアルカロイド、および半合成インドール誘導体の潜在的な治療効果が広く研究の注目を集めている35,36,37。例えば、ハロゲン化インドールは、持続感染する大腸菌および黄色ブドウ球菌の細胞を殺菌することが報告されている37。さらに、ハロゲン化インドールの他の種、属、界に対する有効性を研究することは科学的に興味深い課題であり、本研究はその目標達成に向けた一歩となる。
本稿では、可逆的細胞傷害（RCI）とメチル化に基づく、5-ヨードインドール誘発性C. elegans致死のメカニズムを提案する（図4Cおよび5）。腫脹や液胞変性といった浮腫性変化は、RCIとメチル化の指標であり、細胞質内に巨大液胞として現れる48,49。RCIは、ATP産生を減少させ、ATPaseポンプの機能不全を引き起こしたり、細胞膜を破壊してNa+、Ca2+、水の急速な流入を引き起こしたりすることで、エネルギー産生を阻害する50,51,52。動物細胞における細胞質内液胞は、Ca2+と水の流入による細胞質内への液体蓄積の結果として発生する53。興味深いことに、この細胞損傷のメカニズムは、損傷が一時的であれば可逆的であり、細胞は一定期間 ATP を生成し始めますが、損傷が持続または悪化すると、細胞は死にます。54 私たちの観察では、5-ヨードインドールで処理した線虫は、ストレス条件にさらされた後、正常な生合成を回復できないことが示されています。
5-ヨードインドールによってB. xylophilusにおいて誘導されるメチル化表現型は、ヨウ素の存在とその分子分布に起因する可能性がある。なぜなら、7-ヨードインドールは5-ヨードインドールよりもB. xylophilusに対する阻害効果が弱かったからである（表1および補足図S6）。これらの結果は、Malteseら（2014）の研究結果と部分的に一致する。彼らは、インドール中のピリジル窒素残基をパラ位からメタ位に転座させることで、U251細胞における空胞形成、増殖阻害、および細胞毒性が消失したと報告しており、この分子とタンパク質の特定の活性部位との相互作用が重要であることを示唆している27,44,45。この研究で観察されたインドールまたはハロゲン化インドールとGluCL受容体との相互作用もこの考えを裏付けており、5-ヨードインドールと2-ヨードインドールは、調べた他のインドールよりもGluCL受容体に強く結合することがわかりました（図6および補足図S8）。インドールの2番目または5番目の位置のヨウ素は、バックボーン水素結合を介してGluCL受容体のロイシン218に結合することがわかりましたが、他のハロゲン化インドールとインドール自体はセリン260と弱い側鎖水素結合を形成します（図6）。したがって、ハロゲンの局在が液胞変性の誘導に重要な役割を果たしている一方で、5-ヨードインドールの強固な結合はイオンチャネルを開いたままにし、それによって急速な液体流入と液胞破裂を可能にすると推測されます。しかし、5-ヨードインドールの詳細な作用機序はまだ明らかにされていません。
5-ヨードインドールを実用化する前に、植物に対する毒性作用を分析する必要があります。種子発芽実験では、試験した濃度において、5-ヨードインドールは種子発芽およびその後の発育過程に悪影響を与えないことが示されました（図7）。したがって、本研究は、マツノザイセンチュウによるマツノザイセンチュウの有害性を抑制するために、生態環境において5-ヨードインドールを利用するための根拠を提供するものです。
これまでの報告では、インドールをベースとした治療法が、抗生物質耐性と癌の進行という問題に対処するための潜在的なアプローチであることが示されています55。さらに、インドールは抗菌、抗癌、抗酸化、抗炎症、抗糖尿病、抗ウイルス、抗増殖、抗結核作用を有しており、医薬品開発の有望な基盤となる可能性があります56,57。本研究は、ヨウ素が抗寄生虫薬および駆虫薬として利用できる可能性を初めて示唆しています。
アベルメクチンは30年前に発見され、2015年にノーベル賞を受賞しました。駆虫薬としての使用は今もなお盛んに行われています。しかし、線虫や害虫におけるアベルメクチン耐性の急速な発達により、マツのPWN感染を制御するには、低コストで環境に優しい代替戦略が求められています。本研究では、5-ヨードインドールがマツ線虫を駆除するメカニズムと、植物細胞に対する毒性が低いことも報告されており、将来の商業的応用への期待が高まっています。
すべての実験は韓国慶山市の嶺南大学の倫理委員会によって承認され、方法は嶺南大学の倫理委員会のガイドラインに従って実施されました。
卵の孵化実験は、確立された手順43に従って行われた。孵化率（HR）を評価するために、1日齢の成虫線虫（雌約100匹、雄約100匹）を菌の入ったペトリ皿に移し、24時間生育させた。次に卵を単離し、滅菌蒸留水に懸濁した5-ヨードインドール（0.05 mMおよび0.1 mM）またはアベルメクチン（10 μg/ml）で処理した。これらの懸濁液（500 μl、卵約100個）を24ウェル組織培養プレートのウェルに移し、22 °Cでインキュベートした。24時間のインキュベーション後にL2カウントを実施したが、細い白金線で刺激しても細胞が動かない場合は死んでいるとみなした。この実験は2段階で実施し、各段階で6回繰り返した。 HR のパーセンテージは次のように計算されます。
幼虫の死亡率は、以前に開発された手順を用いて評価しました。線虫の卵を採取し、胚を滅菌蒸留水中で孵化させることで同期させ、L2期幼虫を作製しました。同期させた幼虫（約500匹の線虫）を5-ヨードインドール（0.05 mMおよび0.1 mM）またはアベルメクチン（10 μg/ml）で処理し、B. cinereaペトリ皿で飼育しました。22 °Cで48時間インキュベーションした後、線虫を滅菌蒸留水中に採取し、L2、L3、およびL4期の存在について検査しました。L3およびL4期の存在は幼虫の変態を示し、L2期の存在は変態がないことを示しています。画像はiRiS™デジタル細胞イメージングシステムを用いて取得しました。この実験は2段階で実施し、各段階で6回繰り返しました。両方の実験のデータが統合され、提示されました。
5-ヨードインドールおよびアベルメクチンの種子に対する毒性は、ムラシゲ・スクーグ寒天培地を用いた発芽試験によって評価された。62 B. oleraceaおよびR. raphanistrumの種子は、まず滅菌蒸留水に1日間浸漬し、100%エタノール1 mlで洗浄した後、市販の50%漂白剤（3%次亜塩素酸ナトリウム）1 mlで15分間殺菌し、滅菌水1 mlで5回洗浄した。殺菌した種子を、ムラシゲ・スクーグ培地0.86 g/l（0.2倍）および細菌寒天0.7%を含む発芽寒天培地（5-ヨードインドールまたはアベルメクチン添加または無添加）に圧着した。その後、培地を22℃で培養し、3日間培養した後に画像を撮影した。この実験は 2 段階で実施され、各段階で 6 回ずつ繰り返されました。
投稿日時: 2025年2月26日