マツ線虫は、マツ林生態系に深刻な経済的損失をもたらすことが知られている、検疫対象の移動性内部寄生虫です。本研究では、ハロゲン化インドールのマツ線虫に対する殺線虫活性とその作用機序について検討しました。5-ヨードインドールとアベルメクチン（陽性対照）のマツ線虫に対する殺線虫活性は類似しており、低濃度（10 μg/mL）で高い活性を示しました。5-ヨードインドールは、繁殖力、生殖活動、胚および幼虫の死亡率、運動行動を低下させました。リガンドと無脊椎動物特異的なグルタミン酸作動性塩化物チャネル受容体との分子相互作用は、5-ヨードインドールがアベルメクチンと同様に受容体の活性部位に強く結合するという考えを支持しています。 5-ヨードインドールは、線虫に異常な器官の崩壊/収縮や液胞化の増加など、さまざまな表現型異常を引き起こした。これらの結果は、液胞が線虫のメチル化を介した死に関与している可能性を示唆している。重要なことに、5-ヨードインドールはキャベツとダイコンの両方の植物種に対して無毒であった。したがって、本研究は、環境条件下でのヨードインドールの施用がマツ枯れ病の被害を抑制できることを示している。
マツ材線虫（Bursaphelenchus xylophilus）は、マツ林生態系に深刻な生態学的被害をもたらすことが知られている移動性の内部寄生線虫であるマツ材線虫（PWN）に属します1。マツ材線虫によって引き起こされるマツ枯れ病（PWD）は、アジアやヨーロッパを含むいくつかの大陸で深刻な問題になりつつあり、北米では、この線虫は導入されたマツ種を破壊します1,2。マツの衰退は大きな経済問題であり、その世界的な蔓延の見通しは憂慮すべきものです3。この線虫に最もよく攻撃されるマツ種は、アカマツ、ヨーロッパアカマツ、クロマツ、チョウセンゴヨウ、クロマツ、クロマツ、ラジアータマツです4。マツ材線虫は、感染後数週間から数か月以内にマツを枯死させる深刻な病気です。さらに、マツ線虫の発生はさまざまな生態系でよく見られるため、持続的な感染連鎖が確立されている1。
Bursaphelenchus xylophilus は、アフェレンコイデア上科およびクレード 102.5 に属する検疫対象の植物寄生性線虫です。この線虫は菌類を餌とし、マツの木質組織内で繁殖し、L1、L2、L3、L4 の 4 つの幼虫段階を経て成虫になります 1,6。食料不足の状況下では、マツ線虫は特殊な幼虫段階であるダウアー幼虫に移行し、その媒介者であるマツキクイムシ (Monochamus alternatus) に寄生して、健康なマツの木に移されます。健康な宿主では、線虫は植物組織内を急速に移動し、柔細胞を餌とするため、感染後 1 年以内に多くの過敏症反応、マツの萎凋、そして死に至ります 1,7,8。
マツ線虫の生物的防除は、20世紀に遡る検疫措置以来、長年にわたり課題となってきた。マツ線虫の防除のための現在の戦略は、主に木材燻蒸や樹幹への殺線虫剤の注入などの化学処理を伴う。最も一般的に使用されている殺線虫剤は、アベルメクチン系に属するアベルメクチンとアベルメクチン安息香酸塩である。これらの高価な化学物質は、多くの線虫種に対して非常に効果的であり、環境的に安全であると考えられている9。しかし、これらの殺線虫剤を繰り返し使用すると、選択圧が生じ、ほぼ確実に耐性のあるマツ線虫が出現すると予想される。これは、コガネムシ、コナガ、およびアベルメクチンに対する耐性を徐々に獲得してきた線虫であるトリコストロンギルス・コルブリフォルミスやオステルタギア・サーカムシンクタなどのいくつかの害虫で実証されている10,11,12。そのため、PVDを制御するための代替的で費用対効果が高く環境に優しい対策を見つけるには、耐性パターンを定期的に調査し、殺線虫剤を継続的にスクリーニングする必要があります。近年、多くの研究者が線虫防除剤として植物抽出物、精油、揮発性物質の使用を提案しています13,14,15,16。
我々は最近、細胞間および異種間シグナル分子であるインドールの線虫駆除活性をCaenorhabditis elegansで実証した17。インドールは微生物生態学において広く存在する細胞内シグナルであり、微生物の生理機能、胞子形成、プラスミド安定性、薬剤耐性、バイオフィルム形成、および病原性に影響を与える多数の機能を制御している18, 19。インドールとその誘導体の他の病原性線虫に対する活性は研究されていない。本研究では、34種類のインドールのマツ線虫に対する線虫駆除活性を調査し、顕微鏡観察、タイムラプス撮影、および分子ドッキング実験を使用して最も強力な5-ヨードインドールの作用機序を解明し、種子発芽アッセイを使用して植物に対する毒性効果を評価した。
高濃度（>1.0 mM）のインドールは、線虫に対して殺線虫効果があることが以前に報告されている17。B. xylophilus（様々な生活段階）を1 mMのインドールまたは33種類のインドール誘導体で処理した後、対照群と処理群の生存線虫と死亡線虫を数えることでB. xylophilusの死亡率を測定した。5種類のインドールが有意な殺線虫活性を示した。未処理の対照群の生存率は24時間後に95 ± 7%であった。試験した34種類のインドールのうち、1 mMの5-ヨードインドールと4-フルオロインドールは100%の死亡率を引き起こしたが、5,6-ジフルオロインジゴ、メチルインドール-7-カルボキシレート、および7-ヨードインドールは約50%の死亡率を引き起こした（表1）。
5-ヨードインドールがマツ材線虫の液胞形成と代謝に及ぼす影響。(A) アベルメクチンと5-ヨードインドールが成虫雄線虫、(B) L1期線虫卵、(C) B. xylophilusの代謝に及ぼす影響。(i) 0時間では液胞は観察されなかったが、処理により(ii) 液胞、(iii) 複数の液胞の蓄積、(iv) 液胞の膨張、(v) 液胞の融合、(vi) 巨大液胞の形成が見られた。赤い矢印は液胞の膨張、青い矢印は液胞の融合、黒い矢印は巨大液胞を示す。スケールバー = 50 μm。
さらに、この研究では、マツ線虫におけるメタン誘発死の連続的なプロセスも記述した（図4C）。メタン生成死は、顕著な細胞質空胞の蓄積を伴う非アポトーシス型の細胞死である27。マツ線虫で観察された形態学的欠陥は、メタン誘発死のメカニズムと密接に関連していると思われる。異なる時点での顕微鏡観察では、5-ヨードインドール（0.1 mM）への20時間の曝露後に巨大空胞が形成されたことが示された。処理8時間後には微小空胞が観察され、12時間後にはその数が増加した。14時間後にはいくつかの大きな空胞が観察された。処理12～16時間後にはいくつかの融合空胞がはっきりと見え、空胞融合がメタン生成死メカニズムの基礎であることを示している。20時間後には、線虫全体にいくつかの巨大空胞が見つかった。これらの観察は、C. elegansにおけるメトゥオーシスの最初の報告である。
5-ヨードインドール処理した線虫では、線虫の屈曲や液胞の環境への放出によって示されるように、液胞の凝集と破裂も観察された（図5）。孵化時にL2幼虫によって通常無傷で保たれる卵殻膜でも液胞の破壊が観察された（補足図S2）。これらの観察結果は、液胞形成と化膿の過程に、体液蓄積と浸透圧調節不全、および可逆性細胞損傷（RCI）が関与していることを裏付けている（図5）。
観察された液胞形成におけるヨウ素の役割を仮説として、ヨウ化ナトリウム（NaI）とヨウ化カリウム（KI）の殺線虫活性を調べた。しかし、濃度（0.1、0.5、または1 mM）では、線虫の生存にも液胞形成にも影響はなかった（補足図S5）。ただし、1 mMのKIはわずかに殺線虫効果を示した。一方、7-ヨードインドール（1または2 mM）は、5-ヨードインドールと同様に、複数の液胞と構造的変形を誘発した（補足図S6）。2つのヨードインドールはマツ線虫において同様の表現型特性を示したが、NaIとKIは示さなかった。興味深いことに、インドールは試験した濃度ではB. xylophilusにおいて液胞形成を誘発しなかった（データは示していない）。したがって、今回の結果は、インドール-ヨウ素複合体がB. xylophilusの液胞形成と代謝に関与していることを裏付けた。
殺線虫活性を試験したインドール類の中で、5-ヨードインドールは-5.89 kcal/molという最も高いスリップ指数を示し、次いで7-ヨードインドール（-4.48 kcal/mol）、4-フルオロインドール（-4.33）、インドール（-4.03）の順であった（図6）。5-ヨードインドールのロイシン218への強い主鎖水素結合がその結合を安定化させる一方、他のすべてのインドール誘導体は側鎖水素結合を介してセリン260に結合する。他のモデル化されたヨードインドールの中で、2-ヨードインドールは-5.248 kcal/molの結合値を持ち、これはロイシン218との主要な水素結合によるものです。他の既知の結合には、3-ヨードインドール（-4.3 kcal/mol）、4-ヨードインドール（-4.0 kcal/mol）、および6-フルオロインドール（-2.6 kcal/mol）が含まれます（補足図S8）。 5-ヨードインドールと2-ヨードインドールを除くほとんどのハロゲン化インドールとインドール自体は、セリン260と結合を形成する。ロイシン218との水素結合が、イベルメクチンで観察されたように、効率的な受容体-リガンド結合を示すという事実は（補足図S7）、5-ヨードインドールと2-ヨードインドールが、イベルメクチンと同様に、ロイシン218を介してGluCL受容体の活性部位に強く結合することを裏付けている（図6および補足図S8）。我々は、この結合がGluCL複合体の開いた細孔構造を維持するために必要であり、5-ヨードインドール、2-ヨードインドール、アベルメクチン、およびイベルメクチンがGluCL受容体の活性部位に強く結合することにより、イオンチャネルを開いたままにして体液の取り込みを可能にすると考えている。
インドールおよびハロゲン化インドールのGluCLへの分子ドッキング。GluCLの活性部位への(A)インドール、(B)4-フルオロインドール、(C)7-ヨードインドール、および(D)5-ヨードインドール配位子の結合方向。タンパク質はリボンで表され、主鎖水素結合は黄色の点線で示されている。(A′)、(B′)、(C′)、および(D′)は、対応する配位子と周囲のアミノ酸残基との相互作用を示しており、側鎖水素結合はピンク色の点線矢印で示されている。
キャベツとダイコンの種子の発芽に対する5-ヨードインドールの毒性効果を評価するために実験を行った。5-ヨードインドール（0.05または0.1 mM）またはアベルメクチン（10 μg/mL）は、初期発芽および幼植物の出現にほとんど、あるいは全く影響を与えなかった（図7）。さらに、未処理の対照群と5-ヨードインドールまたはアベルメクチンで処理した種子の発芽率に有意差は認められなかった。主根の伸長および側根の形成数への影響は有意ではなかったが、1 mM（有効濃度の10倍）の5-ヨードインドールは側根の発達をわずかに遅らせた。これらの結果は、5-ヨードインドールが植物細胞に対して無毒であり、検討した濃度では植物の発達過程を阻害しないことを示している。
5-ヨードインドールが種子発芽に及ぼす影響。アベルメクチンまたは5-ヨードインドールを添加した、あるいは添加していないムラシゲ・スクーグ寒天培地における、B. oleraceaおよびR. raphanistrum種子の発芽、発芽、側根形成。発芽は22℃で3日間培養後に記録した。
本研究では、インドール類による線虫駆除の事例をいくつか報告する。特に重要なのは、ヨードインドールが松葉においてメチル化（小さな液胞が蓄積し、徐々に巨大な液胞へと融合し、最終的に膜の破裂と死に至る過程）を誘導することを初めて報告した点であり、ヨードインドールは市販の殺線虫剤アベルメクチンと同様の顕著な殺線虫効果を示すことが明らかになった。
インドールは、原核生物および真核生物において、バイオフィルムの阻害/形成、細菌の生存、病原性など、複数のシグナル伝達機能を発揮することが以前から報告されている19,32,33,34。近年、ハロゲン化インドール、インドールアルカロイド、および半合成インドール誘導体の潜在的な治療効果が、広範な研究関心を集めている35,36,37。例えば、ハロゲン化インドールは、持続性大腸菌および黄色ブドウ球菌細胞を殺滅することが示されている37。さらに、ハロゲン化インドールの他の種、属、および界に対する有効性を研究することは科学的に興味深いことであり、本研究はその目標達成に向けた一歩である。
ここでは、可逆的細胞損傷（RCI）とメチル化に基づく、C. elegansにおける5-ヨードインドール誘発致死のメカニズムを提案する（図4Cおよび5）。浮腫性変化（膨張や空胞変性など）はRCIとメチル化の指標であり、細胞質に巨大な空胞として現れる48,49。RCIはATP産生を減少させ、ATPaseポンプの機能不全を引き起こしたり、細胞膜を破壊してNa+、Ca2+、および水の急速な流入を引き起こしたりすることで、エネルギー産生を阻害する50,51,52。細胞質内空胞は、Ca2+と水の流入による細胞質への体液蓄積の結果として動物細胞に生じる53。興味深いことに、この細胞損傷のメカニズムは、損傷が一時的なもので、細胞が一定期間ATPを生成し始める場合は可逆的ですが、損傷が持続または悪化すると、細胞は死にます。54 私たちの観察では、5-ヨードインドールで処理された線虫は、ストレス条件にさらされた後、正常な生合成を回復できないことが示されています。
5-ヨードインドールによってB. xylophilusに誘導されるメチル化表現型は、ヨウ素の存在とその分子分布によるものと考えられる。なぜなら、7-ヨードインドールは5-ヨードインドールよりもB. xylophilusに対する阻害効果が低かったからである（表1および補足図S6）。これらの結果は、インドール中のピリジル窒素部分をパラ位からメタ位に転位させるとU251細胞における液胞形成、増殖阻害、細胞毒性が消失し、分子とタンパク質の特定の活性部位との相互作用が重要であることを示唆したMalteseら（2014）の研究と部分的に一致している27,44,45。本研究で観察されたインドールまたはハロゲン化インドールとGluCL受容体との相互作用もこの考えを裏付けており、5-ヨードインドールと2-ヨードインドールは、調べた他のインドールよりもGluCL受容体に強く結合することがわかった（図6および補足図S8）。インドールの2番目または5番目の位置にあるヨウ素は、主鎖水素結合を介してGluCL受容体のロイシン218に結合することがわかったが、他のハロゲン化インドールおよびインドール自体は、セリン260と弱い側鎖水素結合を形成する（図6）。したがって、ハロゲンの位置が液胞変性の誘導に重要な役割を果たし、5-ヨードインドールの強い結合がイオンチャネルを開いたままにし、それによって急速な体液流入と液胞破裂を可能にすると推測される。しかし、5-ヨードインドールの詳細な作用機序はまだ解明されていない。
5-ヨードインドールを実用化する前に、植物に対する毒性影響を分析する必要がある。我々の種子発芽実験では、検討した濃度において、5-ヨードインドールは種子発芽やその後の生育過程に悪影響を及ぼさないことが示された（図7）。したがって、本研究は、マツ線虫によるマツへの害を抑制するために、生態環境において5-ヨードインドールを使用する根拠を提供するものである。
これまでの報告では、インドールをベースとした治療法が、抗生物質耐性や癌の進行の問題に対処するための有望なアプローチであることが示されています55。さらに、インドールは抗菌、抗癌、抗酸化、抗炎症、抗糖尿病、抗ウイルス、抗増殖、抗結核活性を有しており、医薬品開発の有望な基盤となる可能性があります56,57。本研究は、ヨウ素を抗寄生虫剤および駆虫剤として使用できる可能性を初めて示唆しています。
アベルメクチンは30年前に発見され、2015年にノーベル賞を受賞し、駆虫薬として現在も活発に利用されています。しかし、線虫や害虫におけるアベルメクチン耐性の急速な発達により、マツのPWN感染を制御するための、代替となる低コストで環境に優しい戦略が必要とされています。本研究では、5-ヨードインドールがマツ線虫を殺虫するメカニズムと、5-ヨードインドールが植物細胞に対して低い毒性を持つことも明らかにしており、将来の商業利用に向けて有望な展望が開かれています。
すべての実験は、韓国慶尚北道慶山市にある嶺南大学倫理委員会の承認を得て実施され、実験方法は嶺南大学倫理委員会のガイドラインに従って行われた。
確立された手順43に従って卵の孵化実験を行った。孵化率（HR）を評価するために、1日齢の成虫線虫（雌約100匹、雄約100匹）を真菌を含むペトリ皿に移し、24時間培養した。次に卵を分離し、滅菌蒸留水に懸濁した5-ヨードインドール（0.05 mMおよび0.1 mM）またはアベルメクチン（10 μg/ml）で処理した。これらの懸濁液（500 μl、卵約100個）を24ウェル組織培養プレートのウェルに移し、22 °Cで培養した。24時間培養後にL2の個体数をカウントしたが、細い白金線で刺激しても細胞が動かない場合は死んでいるとみなした。この実験は2段階で実施し、各段階で6回繰り返した。両方の実験のデータを統合して提示した。 HRの割合は次のように計算されます。
幼虫の死亡率は、以前に開発された手順を使用して評価した。線虫の卵を採取し、胚を滅菌蒸留水中で孵化させて同期させ、L2期幼虫を得た。同期させた幼虫（約500匹の線虫）を5-ヨードインドール（0.05 mMおよび0.1 mM）またはアベルメクチン（10 μg/ml）で処理し、B. cinereaのペトリ皿で飼育した。22 °Cで48時間培養した後、線虫を滅菌蒸留水中で回収し、L2、L3、およびL4期の存在を調べた。L3期およびL4期の存在は幼虫の変態を示し、L2期の存在は変態がないことを示した。画像はiRiS™デジタル細胞イメージングシステムを使用して取得した。この実験は2段階で実施され、各段階で6回ずつ繰り返した。両方の実験のデータを統合して提示した。
5-ヨードインドールとアベルメクチンの種子に対する毒性は、ムラシゲ・スクーグ寒天プレートでの発芽試験を用いて評価した。62 B. oleracea と R. raphanistrum の種子をまず滅菌蒸留水に 1 日浸し、1 ml の 100% エタノールで洗浄し、1 ml の 50% 市販漂白剤 (3% 次亜塩素酸ナトリウム) で 15 分間滅菌し、1 ml の滅菌水で 5 回洗浄した。滅菌した種子を、0.86 g/l (0.2X) のムラシゲ・スクーグ培地と 0.7% 細菌用寒天を含む発芽寒天プレートに、5-ヨードインドールまたはアベルメクチンの有無にかかわらず押し付けた。プレートを 22 °C で培養し、3 日培養後に画像を撮影した。この実験は2段階で行われ、各段階は6回の繰り返し実験で構成された。
投稿日時：2025年2月26日
