植物および病原体材料
イリノイ大学（現カリフォルニア大学デービス校）のパット・ブラウン博士は、ソルガムの系統マッピング集団であるソルガム転換集団（SCP）を提供しました。この集団は以前にも報告されており、米国の環境における植物の成長と発育を促進するために、光周期不感受性と低背化に転換された多様な系統の集合体です。本研究ではこの集団から510系統を使用しましたが、発芽不良などの品質管理上の問題により、すべての系統が3つの形質すべての解析に使用されたわけではありません。最終的に、キチン耐性の解析には345系統、flg22耐性の解析には472系統、TLS耐性の解析には456系統のデータが使用されました。B. クッキーLSLP18 株はアーカンソー大学の Burt Bluhm 博士から入手されました。
MAMP応答測定
本研究では、2種類のMAMPs（flg22、Genscriptカタログ番号RP19986）とキチンを使用しました。ソルガムは、温室内の土壌（Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix 33%）を敷いた平板に挿し木して栽培しました。採取当日に葉に過剰な水分が蓄積するのを防ぐため、採取前日に植物に水を与えました。
系統はランダム化され、ロジスティクス上の理由から60系統ずつのバッチで植えられました。各系統につき、3つの「ポット」に2粒の種子を植えました。次のバッチは、前のバッチの処理が完了次第、全集団の評価が完了するまで植えられました。両MAMPについて2回の実験を行い、それぞれの実験で遺伝子型が再ランダム化されました。
ROSアッセイは前述の通りに実施した。簡単に説明すると、各系統につき6粒の種子を3つの異なるポットに植えた。得られた苗の中から、均一性に基づいて3本を選抜した。見た目が異常であったり、大多数よりも著しく背が高かったり低かったりする苗は使用しなかった。15日齢のソルガム3株から、4枚目の葉の最も広い部分から直径3mmの葉片を4枚切り出した。2株から葉1枚につき1枚の葉片、1株から2枚の葉片を採取し、2枚目の葉片は水分コントロールとした（下記参照）。葉片は黒色96ウェルプレートに50µlの水を入れ、アルミシールで密封して光に当たらないようにし、室温で一晩保存した。翌朝、2 mg/ml 化学発光プローブL-012（Wako、カタログ番号：120-04891）、2 mg/ml 西洋ワサビペルオキシダーゼ（Type VI-A、Sigma-Aldrich、カタログ番号：P6782）、および100 mg/ml キチンまたは2 μM Flg22を用いて反応溶液を調製した。この反応溶液50 μlを4つのウェルのうち3つに加えた。4つ目のウェルはモックコントロールとして、MAMPを除いた反応溶液を加えた。また、各プレートには水のみを入れたブランクウェルを4つ用意した。
反応溶液を添加後、SynergyTM 2マルチ検出マイクロプレートリーダー（BioTek社製）を用いて、1時間にわたり2分ごとに発光を測定した。プレートリーダーは、この1時間の間、2分ごとに発光を測定する。31回の測定結果の合計を各ウェルの値とした。各遺伝子型におけるMAMP反応の推定値は、（3つの実験ウェルの平均発光値 - モックウェルの値）からブランクウェルの平均値を差し引くことで算出した。ブランクウェルの値は常に0に近かった。
葉円盤のニコチアナ・ベンサミアナ品質管理の目的で、各 96 ウェル プレートに、反応性の高いソルガム ライン (SC0003) 1 系統と反応性の低いソルガム ライン (PI 6069) 1 系統もコントロールとして含めました。
B. クッキー接種材料の調製と接種
B. クッキー接種材料は前述の通りに調製した。簡単に説明すると、ソルガムの穀粒を3日間水に浸漬し、すすいだ後、1Lの三角フラスコにすくい取り、15psi、121℃で1時間オートクレーブ処理した。その後、穀粒に、新鮮な培養液から得た浸軟菌糸約5mlを接種した。B. クッキーLSLP18分離株を室温で2週間放置し、フラスコを3日ごとに振盪した。2週間後、菌に感染したソルガム粒を風乾し、圃場接種まで4℃で保管した。試験期間中、同じ接種菌を使用し、毎年新たに接種した。接種には、感染したソルガム粒6～10粒を4～5週齢のソルガムの輪生に植えた。これらの菌から産生された胞子は、1週間以内に若いソルガムに感染を開始した。
種子の準備
圃場に植える前に、ソルガムの種子に、約1%のSpirato 480 FS殺菌剤、4%のSebring 480 FS殺菌剤、3%のSorpro 940 ES種子セーフナーを含む殺菌剤、殺虫剤、およびセーフナーの混合液を処理しました。その後、種子を3日間風乾し、この混合液が種子の周囲に薄く塗布されました。セーフナーにより、除草剤デュアルマグナムを発芽前処理として使用できるようになりました。
標的葉斑病抵抗性の評価
SCPは、ノースカロライナ州クレイトンの中央作物研究ステーションで、ランダム化完全ブロック設計により、2017年6月14～15日と2018年6月20日にそれぞれ2回の実験反復で植えられました。実験は、0.9 mの列幅で1.8 mの単列で、区画ごとに10粒の種子を使用して植えられました。エッジ効果を防ぐため、各実験の周囲に2つの境界列が植えられました。実験は2017年7月20日と2018年7月20日に接種され、その時点でソルガム植物は成長ステージ3でした。評価は1～9のスケールで行われ、病気の兆候を示さない植物は9、完全に死んだ植物は1と評価されました。2017年には2回、2018年には毎年接種後2週間から4回評価が行われました。sAUDPC（標準化病害進行曲線下面積）は前述のように計算されました。
投稿日時: 2021年4月1日