植物および病原体材料
ソルガム変換母集団 (SCP) として知られるソルガム関連マッピング母集団は、イリノイ大学 (現在はカリフォルニア大学デービス校) のパット ブラウン博士によって提供されました。これは以前に記載されており、米国の環境で植物の成長と発達を促進するために、光周期非感受性と低身長に変換された多様な系統のコレクションです。この集団からの 510 系統がこの研究で使用されましたが、発芽不良やその他の品質管理の問題により、すべての系統が 3 つの形質すべての分析に使用されたわけではありません。最終的に、345 系統のデータがキチン応答の分析に使用され、472 系統が flg22 応答に、456 系統が TLS 耐性に使用されました。B.クッケイLSLP18株は、アーカンソー大学のバート・ブルーム博士から入手した。
MAMP応答測定
この研究では、2 つの異なる MAMP、flg22 (Genscript カタログ番号 RP19986)、およびキチンを使用しました。ソルガム植物は、温室内の土壌（33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix）を満たした平地に敷いたインサートで栽培しました。採取当日の余分な葉の湿気を避けるために、サンプル採取の前日に植物に水を与えました。
系統はランダム化され、物流上の理由から、60 系統ずつまとめて植えられました。各系統について、3 つの「ポット」に 1 系統あたり 2 つの種子を植えました。前のバッチが処理されたらすぐに、個体群全体が評価されるまで、後続のバッチを植えました。両方の MAMP に対して 2 回の実験実行が行われ、2 回の実行のそれぞれで遺伝子型が再ランダム化されました。
ROS アッセイは前述のように実行されました。簡単に説明すると、各系統について 6 つの種子を 3 つの異なるポットに植えました。得られた苗の中から均一性を考慮して３本を選抜した。異常に見える苗木、または大部分よりも著しく高いまたは低い苗木は使用されませんでした。直径 3 mm の 4 枚の葉ディスクを、3 つの異なる 15 日齢のソルガム植物の 4 番目の葉の最も広い部分から切除しました。2 つの植物からは葉ごとに 1 つのディスク、1 つの植物からは 2 つのディスクが使用され、2 番目のディスクは水分コントロールになります (下記を参照)。ディスクを黒色の 96 ウェル プレート内の 50 μl H2O に個別に浮かべ、光への曝露を避けるためにアルミニウム シールで密封し、室温で一晩保存しました。翌朝、２ｍｇ／ｍｌの化学発光プローブＬ−０１２（Ｗａｋｏ、カタログ番号１２０−０４８９１）、２ｍｇ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｔｙｐｅ ＶＩ−Ａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ６７８２）を用いて反応溶液を作製した。 100 mg/ml キチンまたは 2 μM の Flg22。この反応液を４ウェル中３ウェルに５０μｌ添加した。4番目のウェルはMAMPを除いた反応液を加えた模擬対照とした。水のみを含む 4 つのブランク ウェルも各プレートに含まれていました。
反応溶液を添加した後、SynergyTM 2マルチ検出マイクロプレートリーダー（BioTek）を使用して、2分ごとに1時間発光を測定した。プレートリーダーは、この 1 時間の間 2 分ごとに発光測定を行います。31 個の測定値すべての合計を計算して、各ウェルの値を求めました。各遺伝子型の MAMP 応答の推定値は、(3 つの実験ウェルの平均発光値 - 模擬ウェル値) - ブランク ウェルの平均値を引いたものとして計算されました。ブランクウェルの値は一貫してゼロに近かった。
リーフディスクベンサミアナタバコ、1 つの高応答性ソルガム系統 (SC0003)、および 1 つの低応答性ソルガム系統 (PI 6069) も、品質管理の目的で各 96 ウェル プレートに対照として含まれました。
B.クッケイ接種菌の調製と接種
B.クッケイ接種材料は前述のように調製されました。簡単に説明すると、ソルガム粒を水に 3 日間浸し、すすぎ、1L 三角フラスコにすくって入れ、15 psi、121 °C で 1 時間オートクレーブ滅菌しました。次いで、穀粒に、新鮮な培養物から得た浸軟菌糸体約5mlを接種した。B.クッケイLSLP18を単離し、3日ごとにフラスコを振盪しながら室温で2週間放置した。2 週間後、真菌に侵されたソルガム粒を風乾し、野外接種まで 4 °C で保管しました。同じ接種材料を試験全体に使用し、毎年新たに作成しました。接種のために、6〜10個の感染した穀物を生後4〜5週目のソルガム植物の輪生の中に配置した。これらの菌類から生成された胞子は、1 週間以内に若いソルガム植物に感染を開始しました。
種子の準備
畑に植える前に、ソルガム種子を、〜 1% の Spirato 480 FS 殺菌剤、4% の Sebring 480 FS 殺菌剤、3% の Sorpro 940 ES 種子安全化剤を含む殺菌剤、殺虫剤、および安全化剤の混合物で処理しました。次に、種子を 3 日間風乾し、種子の周囲にこの混合物の薄いコーティングを形成しました。セーフナーにより、発芽前処理として除草剤デュアルマグナムの使用が可能になりました。
対象となる斑点病抵抗性の評価
SCPは、2017年6月14～15日と2018年6月20日に、ノースカロライナ州クレイトンの中央作物研究所で、それぞれ2回の実験複製を行うランダム化された完全なブロック設計で植えられました。実験では、プロット当たり 10 個の種子を使用して、列幅 0.9 m の 1.8 m の単一列に植えました。エッジ効果を防ぐために、各実験の周囲に 2 つの境界列を植えました。実験は 2017 年 7 月 20 日と 2018 年 7 月 20 日に接種され、その時点でソルガム植物は成長段階 3 にありました。評価は 1 から 9 のスケールで行われ、病気の兆候を示さない植物は 9 としてスコア付けされ、完全に完全に完了したと評価されました。枯れた植物は 1 として採点されました。2017年には2回の評価が行われ、2018年には毎年接種の2週間後に4回の評価が行われた。sAUDPC (疾患進行曲線下の標準化面積) は、前述のように計算されました。
投稿時間: 2021 年 4 月 1 日