植物および病原体材料
ソルガム変換集団（SCP）として知られるソルガム連鎖マッピング集団は、イリノイ大学（現在はカリフォルニア大学デービス校）のパット・ブラウン博士によって提供されました。これは以前にも説明されており、米国環境下での植物の成長と発達を促進するために、光周期不感受性と小型化に改変された多様な系統の集合体です。この集団から510系統が本研究で使用されましたが、発芽不良やその他の品質管理上の問題により、すべての系統が3つの形質すべての分析に使用されたわけではありません。最終的に、キチン応答の分析には345系統、flg22応答の分析には472系統、TLS耐性の分析には456系統のデータが使用されました。B. クケイLSLP18株は、アーカンソー大学のバート・ブルーム博士から入手した。
MAMP応答測定
本研究では、flg22（Genscriptカタログ番号RP19986）とキチンという2種類のMAMPsを使用しました。ソルガム植物は、温室内の土壌（Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix 33%）を入れたトレイに置いたインサートで栽培しました。サンプル採取当日に葉に余分な水分が付着しないように、サンプル採取の前日に植物に水を与えました。
系統はランダム化され、物流上の理由から60系統ずつのバッチで植えられた。各系統につき、3つの「ポット」に1系統あたり2粒の種子が植えられた。前のバッチの処理が完了次第、次のバッチが植えられ、全個体群の評価が完了するまで続けられた。両方のMAMPについて2回の実験が行われ、それぞれの実験で遺伝子型が再ランダム化された。
ROSアッセイは、前述のように実施した。簡単に説明すると、各系統につき6粒の種子を3つの異なる鉢に植えた。得られた苗から、均一性に基づいて3本を選んだ。見た目が異常な苗や、大多数よりも著しく背が高い、または低い苗は使用しなかった。直径3mmの葉ディスク4枚を、15日齢の3つの異なるソルガム植物の4番目の葉の最も広い部分から切り取った。2つの植物からは葉ごとに1枚ずつ、1つの植物からは2枚のディスクを取り、2枚目のディスクは水コントロールとした（下記参照）。ディスクはそれぞれ50µlのH2Oを入れた黒色の96ウェルプレートに浮かべ、光にさらされないようにアルミシールで密封し、室温で一晩保管した。翌朝、2 mg/mlの化学発光プローブL-012（和光純薬工業、カタログ番号120-04891）、2 mg/mlの西洋ワサビペルオキシダーゼ（タイプVI-A、シグマアルドリッチ、カタログ番号P6782）、および100 mg/mlのキチンまたは2 μMのFlg22を用いて反応溶液を調製した。この反応溶液50 µlを4つのウェルのうち3つに添加した。4つ目のウェルはモックコントロールで、MAMPを含まない反応溶液を添加した。各プレートには、水のみを含む4つのブランクウェルも含まれていた。
反応溶液を添加した後、Synergy™ 2 マルチ検出マイクロプレートリーダー（BioTek）を用いて、1 時間にわたり 2 分ごとに発光量を測定した。プレートリーダーはこの 1 時間の間、2 分ごとに発光量を測定した。31 回の測定値の合計を計算し、各ウェルの値とした。各遺伝子型の MAMP 応答の推定値は、（3 つの実験ウェルの平均発光量 - モックウェルの値） - 平均ブランクウェル値を差し引くことで算出した。ブランクウェルの値は常にゼロに近い値であった。
葉の円盤タバコ属のベンサミアナまた、品質管理の目的で、各96ウェルプレートには、反応性の高いソルガム系統（SC0003）と反応性の低いソルガム系統（PI 6069）もコントロールとして含めた。
B. クケイ接種材料の調製と接種
B. クケイ接種源は前述のように調製した。簡単に説明すると、ソルガムの穀粒を3日間水に浸し、すすぎ、1Lの三角フラスコにすくい取り、15psi、121℃で1時間オートクレーブ滅菌した。その後、穀粒に新鮮な培養物から得られた約5mlの粉砕菌糸を接種した。B. クケイLSLP18分離株を室温で2週間放置し、3日ごとにフラスコを振盪した。2週間後、菌に感染したソルガムの穀粒を風乾し、圃場接種まで4℃で保存した。試験全体を通して同じ接種源を使用し、毎年新たに調製した。接種には、6～10粒の感染穀粒を4～5週齢のソルガム植物の葉鞘に置いた。これらの菌から生成された胞子は、1週間以内に若いソルガム植物に感染を開始した。
種子の準備
畑に植える前に、ソルガムの種子を、約1%のSpirato 480 FS殺菌剤、4%のSebring 480 FS殺菌剤、3%のSorpro 940 ES種子保護剤を含む殺菌剤、殺虫剤、および種子保護剤の混合物で処理した。その後、種子を3日間風乾し、種子の周囲にこの混合物の薄いコーティングを形成した。この種子保護剤により、除草剤Dual Magnumを播種前処理として使用することが可能になった。
ターゲット葉斑病耐性の評価
SCPは、2017年6月14～15日と2018年6月20日にノースカロライナ州クレイトンの中央作物研究ステーションで、各実験で2回の反復を伴う完全ランダム化ブロックデザインで植え付けられました。実験は、1.8mの単列で、列幅0.9mで、1区画あたり10粒の種子を使用して植え付けられました。エッジ効果を防ぐために、各実験の周囲に2列の境界列が植えられました。実験は、ソルガム植物が生育段階3であった2017年7月20日と2018年7月20日に接種されました。評価は1から9のスケールで行われ、病気の兆候が見られない植物は9、完全に枯死した植物は1と評価されました。評価は、毎年接種後2週間から2017年に2回、2018年に4回行われました。sAUDPC（標準化された病害進行曲線下の面積）は、前述のように計算されました。
投稿日時：2021年4月1日
