貴州省の降水量の季節分布は不均一で、春と夏に降水量が多いものの、菜種の苗は秋と冬に干ばつのストレスを受けやすく、収穫量に深刻な影響を与えています。カラシナは貴州省で主に栽培されている特殊な油糧作物で、干ばつ耐性が強く、山岳地帯でも栽培できます。干ばつ耐性遺伝子の豊富な資源です。干ばつ耐性遺伝子の発見は、カラシナの品種改良や遺伝資源の革新にとって極めて重要です。GRFファミリーは、植物の成長と発育、および干ばつストレスへの対応において重要な役割を果たしています。現在、GRF遺伝子はシロイヌナズナ2種、イネ（Oryza sativa）12種、菜種13種、ワタ（Gossypium hirsutum）14種、コムギ（Triticum）で発見されています。 GRF遺伝子は、カラシナ（Bjaestivum）15、トウジンビエ（Setaria italica）16、アブラナ（Brassica）17において同定されているが、カラシナにおいて検出されたという報告はない。本研究では、カラシナのGRFファミリー遺伝子をゲノムワイドに同定し、その物理的・化学的特性、進化的関係、相同性、保存モチーフ、遺伝子構造、遺伝子重複、シスエレメント、実生期（四葉期）を解析した。乾燥ストレス下における発現パターンを包括的に解析することで、BjGRF遺伝子の乾燥応答における潜在的機能に関する更なる研究の科学的根拠を提供し、乾燥耐性カラシナ育種のための候補遺伝子を提供することを目指した。
Brassica junceaゲノムにおいて、2回のHMMER検索により34個のBjGRF遺伝子が同定されました。これらの遺伝子はすべてQLQドメインとWRCドメインを含んでいます。同定されたBjGRF遺伝子のCDS配列は補足表S1に示されています。BjGRF01～BjGRF34は、染色体上の位置に基づいて命名されています。このファミリーの物理化学的特性から、アミノ酸長が非常に多様であることが示唆されています。その範囲は261アミノ酸（BjGRF19）から905アミノ酸（BjGRF28）までです。BjGRFの等電点は6.19（BjGRF02）から9.35（BjGRF03）までで、平均は8.33です。BjGRFの88.24%は塩基性タンパク質です。 BjGRF の予測分子量の範囲は 29.82 kDa (BjGRF19) から 102.90 kDa (BjGRF28) です。BjGRF タンパク質の不安定性指数は 51.13 (BjGRF08) から 78.24 (BjGRF19) の範囲で、すべて 40 を超えています。これは脂肪酸指数が 43.65 (BjGRF01) から 78.78 (BjGRF22) の範囲であることを示しています。平均親水性 (GRAVY) は -1.07 (BjGRF31) から -0.45 (BjGRF22) の範囲です。親水性の BjGRF タンパク質はすべて負の GRAVY 値を持ちますが、これは残基による疎水性の欠如によるものと考えられます。細胞内局在予測により、31 個の BjGRF コードタンパク質が核に局在し、BjGRF04 がペルオキシソームに、BjGRF25 が細胞質に、BjGRF28 が葉緑体に局在することが示され (表 1)、BjGRF が核に局在し、転写因子として重要な調節的役割を果たしている可能性があることが示されました。
異なる種のGRFファミリーの系統解析は、遺伝子機能の研究に役立ちます。そこで、35種の菜種、16種のカブ、12種のイネ、10種のキビ、9種のシロイヌナズナGRFの完全長アミノ酸配列をダウンロードし、同定された34種のBjGRF遺伝子に基づいて系統樹を構築しました（図1）。3つのサブファミリーにはそれぞれ異なるメンバー数が含まれています。116種のGRF TFは3つの異なるサブファミリー（グループA～C）に分けられ、それぞれGRFの59（50.86%）、34（29.31%）、23（19.83%）%を占めています。そのうち、34種のBjGRFファミリーメンバーは3つのサブファミリーに分散しており、グループAには13メンバー（38.24%）、グループBには12メンバー（35.29%）、グループCには9メンバー（26.47%）が含まれています。カラシナの倍数化過程において、異なるサブファミリーにおけるBjGRF遺伝子の数は異なり、遺伝子増幅と消失が起こっている可能性があります。注目すべきは、CグループにはイネとキビのGRFが分布していないのに対し、BグループにはイネGRFが2つ、キビGRFが1つ存在し、イネとキビのGRFの大部分が同じ系統に集まっていることです。これは、BjGRFが双子葉植物と近縁であることを示しています。中でも、シロイヌナズナにおけるGRF機能に関する最も詳細な研究は、BjGRFの機能研究の基礎となっています。
Brassica napus、Brassica napus、イネ、キビ、および Arabidopsis thaliana GRF ファミリーのメンバーを含むマスタードの系統樹。
マスタードGRFファミリーにおける反復遺伝子の解析。背景の灰色の線はマスタードゲノム中の同期ブロックを表し、赤い線はBjGRF遺伝子の分節反復ペアを表す。
第4葉期における干ばつストレス下におけるBjGRF遺伝子発現。qRT-PCRデータは補足表S5に示す。データに有意差がある場合は小文字で示す。
地球規模の気候が変化し続ける中、作物が干ばつストレスにどのように対処し、耐性機構を改善するかを研究することが、ホットな研究課題となっている18。干ばつ後、植物の形態構造、遺伝子発現、代謝プロセスが変化し、光合成の停止や代謝障害につながり、作物の収量と品質に影響を与える可能性がある19,20,21。植物は干ばつシグナルを感知すると、Ca2+やホスファチジルイノシトールなどのセカンドメッセンジャーを産生し、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させ、タンパク質リン酸化経路の調節ネットワークを活性化する22,23。最終的な標的タンパク質は細胞防御に直接関与するか、または転写因子を介して関連するストレス遺伝子の発現を制御し、植物のストレス耐性を高める24,25。このように、転写因子は干ばつストレスへの対応において重要な役割を果たしている。干ばつストレス応答性 TF の配列と DNA 結合特性に応じて、TF は GRF、ERF、MYB、WRKY などのさまざまなファミリーに分類できます26。
GRF遺伝子ファミリーは、植物特異的な転写因子の一種であり、成長、発達、シグナル伝達、植物防御反応など、様々な側面で重要な役割を果たしています27。最初のGRF遺伝子がO. sativaで同定されて以来28、多くの種でますます多くのGRF遺伝子が同定され、植物の成長、発達、ストレス応答に影響を及ぼすことが示されています8, 29, 30,31,32。Brassica junceaのゲノム配列の公開により、BjGRF遺伝子ファミリーの同定が可能になりました33。本研究では、マスタードゲノム全体で34個のBjGRF遺伝子が同定され、染色体上の位置に基づいてBjGRF01～BjGRF34と命名されました。これらはすべて、高度に保存されたQLQおよびWRCドメインを含んでいます。物理化学的性質の分析から、BjGRFタンパク質（BjGRF28を除く）のアミノ酸数と分子量の違いは有意でないこと、そしてBjGRFファミリーのメンバーは同様の機能を持つ可能性があることが示されました。遺伝子構造解析では、BjGRF遺伝子の64.7％が4つのエクソンを含んでおり、BjGRF遺伝子構造は進化において比較的保存されていることを示していますが、BjGRF10、BjGRF16、BjGRP28およびBjGRF29遺伝子のエクソン数はより多くなっています。研究では、エクソンまたはイントロンの追加または削除によって遺伝子構造と機能に違いが生じ、それによって新しい遺伝子が作り出される可能性があることが示されています34,35,36。したがって、BjGRFのイントロンは進化の過程で失われ、それが遺伝子機能の変化を引き起こしたのではないかと推測しています。既存の研究と一致して、イントロンの数は遺伝子発現と関連していることもわかりました。遺伝子内のイントロンの数が多いと、遺伝子はさまざまな不利な要因に素早く反応することができます。
遺伝子重複はゲノム進化と遺伝子進化の主要な要因である37。関連研究では、遺伝子重複はGRF遺伝子の数を増やすだけでなく、植物がさまざまな悪環境条件に適応するのに役立つ新しい遺伝子を生成する手段としても機能することが示されています38。この研究では、合計48の重複遺伝子ペアが見つかり、それらはすべて分節重複であったことから、分節重複がこのファミリーの遺伝子の数を増やす主なメカニズムであることを示しています。文献では、分節重複がシロイヌナズナとイチゴのGRF遺伝子ファミリーメンバーの増幅を効果的に促進できることが報告されており、この遺伝子ファミリーのタンデム重複はどの種でも見つかりませんでした27,39。この研究の結果は、シロイヌナズナとイチゴ科の既存の研究と一致しており、GRFファミリーが異なる植物で分節重複を通じて遺伝子の数を増やし、新しい遺伝子を生成できることを示唆しています。
本研究では、マスタードにおいて合計34個のBjGRF遺伝子が同定され、3つのサブファミリーに分類されました。これらの遺伝子は、類似した保存モチーフと遺伝子構造を示しました。共線性解析の結果、マスタードには48対のセグメント重複が認められました。BjGRFプロモーター領域には、光応答、ホルモン応答、環境ストレス応答、および成長と発達に関連するシス作用性要素が含まれています。マスタードの実生段階（根、茎、葉）で34個のBjGRF遺伝子の発現が検出され、干ばつ条件下では10個のBjGRF遺伝子の発現パターンが確認されました。干ばつストレス下におけるBjGRF遺伝子の発現パターンは類似しており、類似している可能性があることがわかりました。干ばつ強制制御への関与。 BjGRF03遺伝子とBjGRF32遺伝子は干ばつストレスにおいて正の調節的役割を果たす可能性があり、BjGRF06遺伝子とBjGRF23遺伝子はmiR396標的遺伝子として干ばつストレスにおいて役割を果たしている。全体として、本研究はアブラナ科植物におけるBjGRF遺伝子の機能に関する将来の発見に向けた生物学的基礎を提供するものである。
本実験に使用したカラシナ種子は、貴州省農業科学院貴州油糧種子研究所から提供されたものです。種子を丸ごと選別し、土壌（基質：土壌＝3：1）に植え、四葉期以降に根、茎、葉を採取しました。植物は干ばつを模擬するため、20%のPEG 6000で処理し、0、3、6、12、24時間後に葉を採取しました。すべての植物サンプルは直ちに液体窒素で凍結し、次の試験のために-80℃の冷凍庫に保管しました。
この研究中に取得または分析されたすべてのデータは、公開された論文および補足情報ファイルに含まれています。
投稿日時: 2025年1月22日