貴州省の降水量の季節分布は不均一で、春と夏に降水量が多いが、秋と冬には菜種苗が干ばつストレスを受けやすく、収量に深刻な影響を及ぼしている。カラシナは貴州省で主に栽培されている特別な油糧作物である。カラシナは干ばつ耐性が強く、山岳地帯でも栽培できる。干ばつ耐性遺伝子の豊富な資源である。干ばつ耐性遺伝子の発見は、カラシナ品種の改良と遺伝資源の革新にとって極めて重要である。GRFファミリーは、植物の成長と発達、および干ばつストレスへの応答において重要な役割を果たしている。現在までに、GRF遺伝子はシロイヌナズナ2、イネ（Oryza sativa）12、菜種13、ワタ（Gossypium hirsutum）14、コムギ（Triticum）で発見されている。カラシナではGRF遺伝子が検出されたという報告はないが、カラシナではGRF遺伝子が検出されたという報告はない。本研究では、カラシナのGRFファミリー遺伝子をゲノムワイドレベルで同定し、その物理的および化学的特性、進化関係、相同性、保存モチーフ、遺伝子構造、遺伝子重複、シスエレメント、および実生段階（4葉期）を分析した。干ばつストレス下での発現パターンを包括的に分析し、干ばつ応答におけるBjGRF遺伝子の潜在的な機能に関するさらなる研究の科学的根拠を提供するとともに、干ばつ耐性カラシナの育種のための候補遺伝子を提供する。
2つのHMMER検索を用いて、Brassica junceaゲノムから34個のBjGRF遺伝子が同定され、それらはすべてQLQドメインとWRCドメインを含んでいた。同定されたBjGRF遺伝子のCDS配列は補足表S1に示されている。BjGRF01～BjGRF34は染色体上の位置に基づいて命名されている。このファミリーの物理化学的特性は、アミノ酸長が非常に多様であり、261アミノ酸（BjGRF19）から905アミノ酸（BjGRF28）までであることを示している。BjGRFの等電点は6.19（BjGRF02）から9.35（BjGRF03）までで、平均は8.33であり、BjGRFの88.24%は塩基性タンパク質である。 BjGRFの予測分子量範囲は29.82 kDa（BjGRF19）から102.90 kDa（BjGRF28）です。BjGRFタンパク質の不安定性指数は51.13（BjGRF08）から78.24（BjGRF19）の範囲で、すべて40より大きく、脂肪酸指数は43.65（BjGRF01）から78.78（BjGRF22）の範囲、平均親水性（GRAVY）は-1.07（BjGRF31）から-0.45（BjGRF22）の範囲で、すべての親水性BjGRFタンパク質は負のGRAVY値を示しており、これは残基による疎水性の欠如によるものと考えられます。細胞内局在予測では、31個のBjGRFコードタンパク質が核に局在し、BjGRF04がペルオキシソームに局在し、BjGRF25が細胞質に局在し、BjGRF28が葉緑体に局在することが示されました（表1）。これは、BjGRFが核に局在し、転写因子として重要な調節的役割を果たしている可能性を示唆しています。
異なる種における GRF ファミリーの系統解析は、遺伝子機能の研究に役立つ。そのため、35 種のナタネ、16 種のカブ、12 種のイネ、10 種のキビ、9 種のシロイヌナズナの GRF の全長アミノ酸配列をダウンロードし、同定された 34 個の BjGRF 遺伝子に基づいて系統樹を構築した (図 1)。3 つのサブファミリーには異なる数のメンバーが含まれている。116 個の GRF TF は 3 つの異なるサブファミリー (グループ A ～ C) に分けられ、それぞれ GRF の 59 (50.86%)、34 (29.31%)、23 (19.83)% が含まれている。その中で、34 個の BjGRF ファミリーメンバーは 3 つのサブファミリーに分散しており、グループ A に 13 メンバー (38.24%)、グループ B に 12 メンバー (35.29%)、グループ C に 9 メンバー (26.47%) が含まれている。カラシナの倍数体化の過程で、異なるサブファミリーの BjGRF 遺伝子の数は異なり、遺伝子の増幅と消失が起こった可能性がある。注目すべきは、グループ C にはイネとキビの GRF の分布がなく、グループ B には 2 つのイネ GRF と 1 つのキビ GRF があり、イネとキビの GRF のほとんどが 1 つの枝にグループ化されていることであり、これは BjGRF が双子葉植物と密接に関連していることを示している。その中でも、シロイヌナズナの GRF 機能に関する最も詳細な研究は、BjGRF の機能研究の基礎を提供している。
アブラナ科植物（Brassica napus）、イネ、キビ、およびシロイヌナズナGRFファミリーのメンバーを含むカラシナの系統樹。
カラシナGRFファミリーにおける反復遺伝子の解析。背景の灰色の線はカラシナゲノム内の同期ブロックを表し、赤い線はBjGRF遺伝子のセグメント化された反復配列のペアを表します。
第4葉期における干ばつストレス下でのBjGRF遺伝子発現。qRT-PCRデータは補足表S5に示されている。データの有意差は小文字で示されている。
地球規模の気候が変化し続ける中、作物が干ばつストレスにどのように対処し、その耐性メカニズムを改善するかを研究することは、ホットな研究テーマとなっています18。干ばつ後、植物の形態構造、遺伝子発現、代謝プロセスが変化し、光合成の停止や代謝障害につながり、作物の収量と品質に影響を与える可能性があります19,20,21。植物は干ばつシグナルを感知すると、Ca2+やホスファチジルイノシトールなどのセカンドメッセンジャーを生成し、細胞内カルシウムイオン濃度を増加させ、タンパク質リン酸化経路の調節ネットワークを活性化します22,23。最終的な標的タンパク質は、細胞防御に直接関与するか、転写因子を介して関連するストレス遺伝子の発現を調節し、植物のストレス耐性を高めます24,25。したがって、転写因子は干ばつストレスへの応答において重要な役割を果たします。干ばつストレス応答性転写因子の配列とDNA結合特性に基づいて、転写因子はGRF、ERF、MYB、WRKYなどの異なるファミリーに分類できます26。
GRF遺伝子ファミリーは、成長、発達、シグナル伝達、植物の防御応答などさまざまな側面で重要な役割を果たす植物特異的転写因子の一種です27。最初のGRF遺伝子がイネ（O. sativa）で同定されて以来28、多くの種でますます多くのGRF遺伝子が同定され、植物の成長、発達、ストレス応答に影響を与えることが示されています8, 29, 30,31,32。カラシナ（Brassica juncea）のゲノム配列の公開により、BjGRF遺伝子ファミリーの同定が可能になりました33。この研究では、カラシナゲノム全体で34個のBjGRF遺伝子が同定され、染色体上の位置に基づいてBjGRF01～BjGRF34と命名されました。これらはすべて、高度に保存されたQLQドメインとWRCドメインを含んでいます。物理化学的特性の分析により、BjGRFタンパク質（BjGRF28を除く）のアミノ酸数と分子量の違いは有意ではないことが示され、BjGRFファミリーメンバーは同様の機能を持つ可能性があることが示唆されました。遺伝子構造解析の結果、BjGRF遺伝子の64.7%が4つのエクソンを含んでいることが示され、BjGRF遺伝子構造は進化的に比較的保存されていることがわかったが、BjGRF10、BjGRF16、BjGRP28、BjGRF29遺伝子のエクソン数はより多い。エクソンまたはイントロンの追加または削除は、遺伝子構造と機能の違いにつながり、それによって新しい遺伝子が作られることが研究で示されている34,35,36。したがって、我々は、BjGRFのイントロンが進化の過程で失われ、遺伝子機能の変化を引き起こした可能性があると推測する。既存の研究と一致して、我々はまた、イントロンの数が遺伝子発現と関連していることを発見した。遺伝子のイントロンの数が多い場合、遺伝子はさまざまな不利な要因に迅速に対応することができる。
遺伝子重複はゲノムおよび遺伝的進化における主要な要因である37。関連研究では、遺伝子重複はGRF遺伝子の数を増やすだけでなく、植物がさまざまな不利な環境条件に適応するのに役立つ新しい遺伝子を生成する手段としても機能することが示されている38。本研究では合計48個の重複遺伝子ペアが見つかり、それらはすべてセグメント重複であり、セグメント重複がこのファミリーの遺伝子の数を増やす主要なメカニズムであることを示している。文献では、セグメント重複がシロイヌナズナとイチゴのGRF遺伝子ファミリーメンバーの増幅を効果的に促進できることが報告されており、いずれの種でもこの遺伝子ファミリーのタンデム重複は見つかっていない27,39。本研究の結果は、シロイヌナズナとイチゴのファミリーに関する既存の研究と一致しており、GRFファミリーはさまざまな植物でセグメント重複によって遺伝子の数を増やし、新しい遺伝子を生成できることを示唆している。
本研究では、カラシナにおいて合計34個のBjGRF遺伝子が同定され、これらは3つのサブファミリーに分類された。これらの遺伝子は類似した保存モチーフと遺伝子構造を示した。共線性解析により、カラシナには48対のセグメント重複が認められた。BjGRFプロモーター領域には、光応答、ホルモン応答、環境ストレス応答、成長および発達に関連するシス作用性エレメントが含まれている。カラシナの苗期（根、茎、葉）において34個のBjGRF遺伝子の発現が検出され、干ばつ条件下での10個のBjGRF遺伝子の発現パターンが調べられた。干ばつストレス下でのBjGRF遺伝子の発現パターンは類似しており、干ばつ強制調節に関与している可能性があることが判明した。 BjGRF03遺伝子とBjGRF32遺伝子は干ばつストレスにおいて正の調節的役割を果たす可能性があり、一方、BjGRF06遺伝子とBjGRF23遺伝子はmiR396の標的遺伝子として干ばつストレスに関与していると考えられる。本研究は、アブラナ科植物におけるBjGRF遺伝子機能の今後の解明に向けた生物学的基盤を提供するものである。
本実験で使用したカラシナの種子は、貴州省農業科学院貴州油糧種子研究所から提供された。種子を選別し、土壌（基質：土壌＝3：1）に植え、4葉期以降に根、茎、葉を採取した。植物に20% PEG 6000処理を施して乾燥状態を再現し、0、3、6、12、24時間後に葉を採取した。採取した植物サンプルはすべて直ちに液体窒素で凍結し、次の試験まで-80℃の冷凍庫に保管した。
本研究で取得または分析されたすべてのデータは、発表された論文および補足情報ファイルに含まれている。
投稿日時：2025年1月22日
