合成殺虫剤の広範な使用は、耐性生物の出現、環境悪化、人間の健康への害など、多くの問題を引き起こしています。したがって、新しい微生物は、殺虫剤人間の健康と環境にとって安全な製品が緊急に必要とされています。この研究では、Enterobacter cloacae SJ2 によって生成されるラムノリピド生物界面活性剤を使用して、蚊 (Culex quinquefasciatus) およびシロアリ (Odontotermes obesus) の幼虫に対する毒性を評価しました。結果は、治療ごとに用量依存的な死亡率があることを示しました。シロアリおよび蚊の幼虫の生物界面活性剤の 48 時間での LC50 (50% 致死濃度) 値は、非線形回帰曲線フィッティング法を使用して決定されました。結果は、バイオサーファクタントの殺幼虫活性および抗シロアリ活性の 48 時間 LC50 値 (95% 信頼区間) がそれぞれ 26.49 mg/L (範囲 25.40 ～ 27.57) および 33.43 mg/L (範囲 31.09 ～ 35.68) であることを示しました。病理組織学的検査によると、生物界面活性剤による処理は幼虫とシロアリの細胞小器官組織に深刻な損傷を引き起こしました。この研究の結果は、Enterobacter cloacae SJ2 によって生成される微生物バイオサーファクタントが、Cx 制御のための優れた潜在的に効果的なツールであることを示しています。quinquefasciatus および O. obesus。
熱帯諸国では、蚊が媒介する病気が多数発生しています1。蚊が媒介する病気の関連性は広範囲に及んでいます。毎年 40 万人以上がマラリアで死亡しており、一部の主要都市ではデング熱、黄熱病、チクングニア熱、ジカ熱などの重篤な病気が流行しています。2 ベクター媒介疾患は世界中の感染症の 6 件に 1 件と関連しており、最も多くの原因を引き起こしているのは蚊です。重大なケース3、4。アカイエカ、ハマダラカ、ヤブカ属は、病気の伝播に最もよく関連する 3 属の蚊です5。ネッタイシマカによって伝播される感染症であるデング熱の有病率は過去 10 年間で増加しており、公衆衛生上の重大な脅威となっています 4,7,8。世界保健機関 (WHO) によると、世界人口の 40% 以上がデング熱のリスクにさらされており、100 か国以上で毎年 5,000 万～1 億人の新規感染者が発生しています9、10、11。デング熱は世界中で発生率が増加しており、大きな公衆衛生問題となっています12、13、14。一般にアフリカハマダラカとして知られるハマダラカハマダラカは、熱帯および亜熱帯地域におけるヒトマラリアの最も重要な媒介動物です15。西ナイルウイルス、セントルイス脳炎、日本脳炎、および馬や鳥のウイルス感染症は、一般的にイエカと呼ばれるアカイエカによって伝染します。さらに、それらは細菌性疾患や寄生虫性疾患の保因者でもあります16。世界には 3,000 種以上のシロアリが存在し、1 億 5,000 万年以上前から存在しています17。ほとんどの害虫は土壌に生息し、セルロースを含む木材および木製品を餌とします。インドシロアリ Odontotermes obesus は、重要な作物や植林木に深刻な被害をもたらす重要な害虫です18。農業地域では、さまざまな段階でのシロアリの侵入が、さまざまな作物、樹種、建築資材に多大な経済的損害を引き起こす可能性があります。シロアリは人間の健康上の問題も引き起こす可能性があります19。
今日の製薬および農業分野における微生物や害虫に対する耐性の問題は複雑です20,21。したがって、両社は、新しい費用対効果の高い抗菌剤と安全な生物農薬を探す必要があります。合成殺虫剤は現在入手可能であり、感染性があり、標的以外の有益な昆虫を忌避することが示されています22。近年、バイオサーファクタントの研究は、さまざまな産業での応用により拡大しています。バイオサーファクタントは、農業、土壌浄化、石油抽出、バクテリアや昆虫の除去、食品加工において非常に有用かつ不可欠です23,24。バイオサーファクタントまたは微生物界面活性剤は、沿岸の生息地や石油汚染地域で細菌、酵母、真菌などの微生物によって生成されるバイオサーファクタント化学物質です25、26。化学的に誘導された界面活性剤と生物界面活性剤は、自然環境から直接得られる 2 種類です27。さまざまな生物界面活性剤は海洋生息地から得られます 28,29。したがって、科学者は、天然細菌に基づいてバイオ界面活性剤を製造するための新しい技術を探しています30,31。このような研究の進歩は、環境保護におけるこれらの生物学的化合物の重要性を実証しています32。バチルス、シュードモナス、ロドコッカス、アルカリゲネス、コリネバクテリウムおよびこれらの細菌属はよく研究されている代表的な細菌です 23,33。
バイオ界面活性剤には、幅広い用途を持つ多くの種類があります34。これらの化合物の重要な利点は、それらの一部が抗菌、幼虫駆除、殺虫活性を持っていることです。これは、農業、化学、製薬、化粧品業界で使用できることを意味します35、36、37、38。バイオサーファクタントは一般に生分解性で環境に有益であるため、作物を保護するための統合害虫管理プログラムで使用されています39。したがって、Enterobacter cloacae SJ2 によって産生される微生物バイオサーファクタントの殺幼虫活性および抗シロアリ活性についての基礎的な知識が得られました。私たちは、さまざまな濃度のラムノリピド生物界面活性剤に曝露したときの死亡率と組織学的変化を調べました。さらに、微細藻類、ミジンコ、魚に対する急性毒性を決定するために、広く使用されている定量的構造活性度 (QSAR) コンピューター プログラム生態学的構造活性度 (ECOSAR) を評価しました。
この研究では、インドシロアリ、O. obesus および 4 番目の種に対して、30 ～ 50 mg/ml (5 mg/ml 間隔) の範囲のさまざまな濃度で精製バイオサーファクタントの抗シロアリ活性 (毒性) を評価しました。Cx齢の幼虫。蚊の幼虫。O. obesus および Cx に対する 48 時間にわたるバイオサーファクタントの LC50 濃度。C.ソラナセアラム。蚊の幼虫は、非線形回帰曲線フィッティング法を使用して識別されました。その結果、バイオサーファクタントの濃度が増加するとシロアリの死亡率が増加することが示されました。結果は、バイオサーファクタントが幼虫駆除活性 (図 1) と抗シロアリ活性 (図 2) を有し、48 時間の LC50 値 (95% CI) が 26.49 mg/L (25.40 ～ 27.57 ) および 33.43 mg/L であることを示しました。 l (図 31.09 ～ 35.68)、それぞれ (表 1)。急性毒性 (48 時間) の観点から、バイオサーファクタントは試験対象の微生物に対して「有害」であると分類されています。この研究で生成されたバイオサーファクタントは、暴露後 24 ～ 48 時間以内に 100% 死亡する優れた幼虫駆除活性を示しました。
幼虫駆除活性の LC50 値を計算します。相対死亡率 (%) の非線形回帰曲線フィッティング (実線) および 95% 信頼区間 (斜線領域)。
抗シロアリ活性の LC50 値を計算します。相対死亡率 (%) の非線形回帰曲線フィッティング (実線) および 95% 信頼区間 (斜線領域)。
実験の最後に、形態学的変化と異常が顕微鏡で観察されました。形態学的変化は、対照群と治療群で40倍の倍率で観察されました。図 3 に示すように、生物界面活性剤で処理した幼虫の大部分で成長障害が発生しました。図 3a は通常の Cx を示しています。quinquefasciatus、図 3b は異常な Cx を示しています。線虫の幼虫を5匹発生させる。
亜致死量（LC50）用量のバイオサーファクタントがアカイエカ幼虫の発育に及ぼす影響。40 倍の倍率での通常の Cx の光学顕微鏡画像 (a)。quinquefasciatus (b) 異常な Cx。線虫幼虫5匹を発生させる。
本研究では、処理した幼虫（図4）とシロアリ（図5）の組織学的検査により、腹部面積の減少、筋肉、上皮層、皮膚の損傷など、いくつかの異常が明らかになりました。中腸。組織学により、この研究で使用された生物界面活性剤の阻害活性のメカニズムが明らかになりました。
正常な未処理の 4 齢 Cx 幼虫の組織病理学。quinquefasciatus 幼虫 (対照: (a,b)) およびバイオサーファクタントで処理 (処理: (c,d))。矢印は、処理された腸上皮 (epi)、核 (n)、および筋肉 (mu) を示します。バー = 50 μm。
正常な未処理の O. obesus (対照: (a、b)) および生物界面活性剤処理 (治療: (c、d)) の組織病理学。矢印はそれぞれ腸上皮 (epi) と筋肉 (mu) を示します。バー = 50 μm。
この研究では、ECOSAR を使用して、一次生産者 (緑藻)、一次消費者 (ミジンコ)、および二次消費者 (魚) に対するラムノリピド バイオサーファクタント製品の急性毒性を予測しました。このプログラムは、高度な定量的構造活性化合物モデルを使用して、分子構造に基づいて毒性を評価します。このモデルは、構造活性度 (SAR) ソフトウェアを使用して、水生種に対する物質の急性および長期毒性を計算します。具体的には、表 2 は、いくつかの種の推定平均致死濃度 (LC50) と平均有効濃度 (EC50) をまとめたものです。疑いのある毒性は、化学物質の分類および表示に関する世界調和システムを使用して 4 つのレベルに分類されました (表 3)。
ベクター媒介疾患、特に蚊およびネッタイシマカの系統の制御。エジプト人よ、今は困難な仕事をしている40、41、42、43、44、45、46。ピレスロイドや有機リン酸塩などの化学的に入手可能な農薬はある程度有益ではありますが、糖尿病、生殖障害、神経障害、癌、呼吸器疾患など人間の健康に重大なリスクをもたらします。さらに、時間の経過とともに、これらの昆虫はそれらに対して耐性を持つようになる可能性があります13,43,48。したがって、効果的で環境に優しい生物学的防除手段は、蚊の防除方法としてより一般的なものになるでしょう49,50。Benelli は 51、都市部では蚊を媒介する蚊を早期に防除することがより効果的であると示唆したが、農村地域での幼虫剤の使用は推奨しなかった 52。Tomら 53 は、蚊は防除剤に対してより敏感であるため、未成熟段階で防除することが安全で簡単な戦略であると示唆した 54 。
強力な菌株 (Enterobacter cloacae SJ2) によるバイオサーファクタントの生産は、一貫した有望な有効性を示しました。私たちの以前の研究では、Enterobacter cloacae SJ2 が物理化学的パラメーターを使用してバイオサーファクタントの生産を最適化することが報告されました26。彼らの研究によると、潜在的な E. cloacae 分離株によるバイオサーファクタント生成の最適条件は、36 時間のインキュベーション、150 rpm での撹拌、pH 7.5、37 °C、塩分 1 ppt、炭素源として 2% グルコース、1% 酵母でした。 。抽出物を窒素源として使用して、2.61 g/Lのバイオサーファクタントを得ました。さらに、TLC、FTIR、MALDI-TOF-MS を使用してバイオ界面活性剤の特性評価を行いました。これにより、ラムノリピドが生物界面活性剤であることが確認されました。糖脂質バイオサーファクタントは、他の種類のバイオサーファクタントの中で最も集中的に研究されているクラスです55。それらは炭水化物部分と脂質部分、主に脂肪酸鎖で構成されています。糖脂質の中で代表的なものはラムノリピッドとソホロ脂質である56。ラムノリピドには、モノ-またはジ-β-ヒドロキシデカン酸に結合した 2 つのラムノース部分が含まれています 57 。最近の殺虫剤としての使用に加えて、医療および製薬産業におけるラムノリピドの使用は十分に確立されている 58。
バイオサーファクタントと呼吸サイフォンの疎水性領域との相互作用により、水がその気孔を通過できるようになり、それによって幼虫と水生環境との接触が増加します。生物界面活性剤の存在は気管にも影響を与えます。気管はその長さが表面に近く、幼虫が表面に這って呼吸しやすくなります。その結果、水の表面張力が低下します。幼虫は水面に付着できないため、水槽の底に落ちて静水圧が破壊され、その結果過剰なエネルギーが消費され、溺死してしまいます38,60。同様の結果がGhribi61でも得られ、枯草菌が産生するバイオ界面活性剤がエフェスティア・クエニエラに対して殺幼虫活性を示した。同様に、Cxの幼虫駆除活性。Das と Mukherjee23 は、quinquefasciatus 幼虫に対する環状リポペプチドの効果も評価しました。
この研究の結果は、ラムノリピド生物界面活性剤の Cx に対する殺幼虫活性に関するものです。quinquefasciatus 蚊の駆除は、以前に発表された結果と一致しています。例えば、バチルス属の様々な細菌によって産生されるサーファクチンベースのバイオサーファクタントが使用される。およびシュードモナス属。いくつかの初期の報告 64、65、66 では、枯草菌由来のリポペプチドバイオサーファクタントの幼虫殺害活性が報告されています 23。ディーパリら。63 は、Stenotropomonas maltophilia から単離されたラムノリピド生物界面活性剤が、10 mg/L の濃度で強力な殺幼虫活性を有することを発見しました。シルバら。67 は、1 g/L の濃度でのラムノリピド生物界面活性剤の Ae に対する殺幼虫活性を報告しました。ネッタイシマカ。カナクダンデら。68は、枯草菌によって産生されるリポペプチド生物界面活性剤が、ユーカリの親油性画分を含むアカイエカ幼虫およびシロアリの全死亡を引き起こすと報告した。同様に、Masendra ら。69 人が、E. 粗抽出物の親油性 n-ヘキサンおよび EtOAc 画分における働きアリ (Cryptotermes cynocepalus Light.) の死亡率が 61.7% であると報告しました。
Parthipan et al 70は、マラリア原虫Plasmodiumのベクターであるハマダラカハマダラカに対するBacillus subtilis A1およびPseudomonas stutzeri NA3によって生成されるリポペプチド生物界面活性剤の殺虫用途を報告した。彼らは、異なる濃度の生物界面活性剤で処理すると、幼虫と蛹がより長く生存し、産卵期間が短く、無菌であり、寿命が短くなることが観察されました。枯草菌バイオサーファクタント A1 の実測 LC50 値は、異なる幼虫状態 (すなわち、幼虫 I、II、III、IV および蛹期) でそれぞれ 3.58、4.92、5.37、7.10、および 7.99 mg/L でした。比較すると、Pseudomonas stutzeri NA3 の幼虫期 I ～ IV および蛹期のバイオサーファクタントは、それぞれ 2.61、3.68、4.48、5.55、および 6.99 mg/L でした。生き残った幼虫と蛹の生物季節学の遅れは、殺虫剤処理によって引き起こされる重大な生理学的および代謝障害の結果であると考えられています71。
Wickerhamomyces anomalus CCMA 0358 株は、ヤブカ属の蚊に対して 100% 殺幼虫活性を持つバイオサーファクタントを生成します。ネッタイシマカの 24 時間間隔 38 は、Silva らの報告よりも高かった。ヒマワリ油を炭素源として使用して緑膿菌から生成されるバイオサーファクタントは、48 時間以内に幼虫を 100% 殺すことが示されています 67 。Abinaya et al.72 および Pradhan et al.73 もまた、バチルス属のいくつかの分離株によって産生される界面活性剤の幼虫駆除効果または殺虫効果を実証した。Senthil-Nathan らによって以前に発表された研究。植物のラグーンに曝露された蚊の幼虫は 100% 死亡する可能性が高いことを発見しました。74.
致死量未満の用量/濃度では昆虫を殺すことはできませんが、生物学的特性を破壊することで将来世代の昆虫の個体数を減らす可能性があるため、昆虫の生物学に対する殺虫剤の亜致死効果を評価することは、総合的な害虫管理プログラムにとって重要です10。Siqueira ら 75 は、50 ～ 300 mg/ml の範囲のさまざまな濃度で試験した場合、ラムノリピド生物界面活性剤 (300 mg/ml) の完全な幼虫駆除活性 (100% 死亡率) を観察しました。ネッタイシマカの幼虫期。彼らは、幼虫の生存と水泳活動に対する死亡までの時間と亜致死濃度の影響を分析しました。さらに、亜致死濃度のバイオサーファクタント（例：50 mg/mL および 100 mg/mL）に 24 ～ 48 時間曝露すると、遊泳速度の低下が観察されました。準致死性の役割が期待できる毒は、暴露された害虫に複数の被害を与えるのにより効果的であると考えられています76。
我々の結果の組織学的観察は、Enterobacter cloacae SJ2 によって産生されるバイオサーファクタントが蚊 (Cx. quinquefasciatus) とシロアリ (O. obesus) の幼虫の組織を著しく変化させることを示しています。同様の異常は、アンのバジル油の調製によって引き起こされました。gambiaes.s と An.アラビカ種は Ochola77 によって説明されました。また、Kamaraj et al.78 も、An における同じ形態学的異常について記載しています。ステファニーの幼虫は金ナノ粒子に曝露されました。Vasantha-Srinivasan ら 79 は、ナズナのエッセンシャル オイルがヒトスジシマカの体腔と上皮層に深刻な損傷を与えたと報告しました。ネッタイシマカ。Raghavendran らは、蚊の幼虫を地元のペニシリウム菌の菌糸体抽出物 500 mg/ml で処理したと報告しました。Aeは重度の組織学的損傷を示します。ネッタイシマカとCx。死亡率 80。以前、Abinaya et al.アンの４齢幼虫を研究した。スティーブンシーとエイ。ネッタイシマカは、B.リケニフォルミス外多糖類で処理したネッタイシマカで、胃盲腸、筋萎縮、神経索神経節の損傷および組織崩壊など、多数の組織学的変化を発見した72。Raghavendran らによると、P. daleae 菌糸体抽出物で処理した後、試験した蚊 (4 齢幼虫) の中腸細胞は、腸内腔の膨張、細胞間内容物の減少、および核変性を示しました 81。同じ組織学的変化がエキナセア葉抽出物で処理された蚊の幼虫でも観察され、処理された化合物の殺虫能力が示されました50。
ECOSAR ソフトウェアの使用は国際的に認められています82。現在の研究では、微細藻類 (C. vulgaris)、魚およびミジンコ (D. magna) に対する ECOSAR バイオサーファクタントの急性毒性は、国連が定義する「毒性」カテゴリーに該当することが示唆されています83。ECOSAR 生態毒性モデルは、SAR と QSAR を使用して物質の急性および長期毒性を予測し、有機汚染物質の毒性を予測するためによく使用されます 82,84。
この研究で使用したパラホルムアルデヒド、リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.4)、およびその他の化学物質はすべて、インドの HiMedia Laboratories から購入しました。
バイオサーファクタントの生産は、唯一の炭素源として 1% 原油を補充した 200 mL の滅菌 Bushnell Haas 培地を含む 500 mL 三角フラスコ中で実行されました。Enterobacter cloacae SJ2 (1.4 × 104 CFU/ml) の前培養物を接種し、オービタルシェーカー上で 37℃、200 rpm で 7 日間培養しました。インキュベーション期間の後、培養培地を 4℃、3400 xg で 20 分間遠心分離することによってバイオサーファクタントを抽出し、得られた上清をスクリーニング目的に使用しました。生物界面活性剤の最適化手順と特性評価は、以前の研究から採用されました26。
イエカアカイエカの幼生は、タミル・ナドゥ州パランチペタイの海洋生物学先端研究センター (CAS) から入手しました。幼虫は、脱イオン水を満たしたプラスチック容器内で、27±2℃、光周期12:12(明:暗)で飼育した。蚊の幼虫には 10% グルコース溶液が与えられました。
イエカアカイエの幼虫は、開放された保護されていない浄化槽で発見されています。標準的な分類ガイドラインを使用して、実験室で幼虫を識別し、培養します85。幼虫駆除試験は、世界保健機関の推奨に従って実施されました 86。SH.quinquefasciatus の 4 令幼虫を、容量の 3 分の 2 のエアギャップを備えた 25 ml および 50 ml のグループに分けて密閉管に集めました。バイオサーファクタント (0 ～ 50 mg/ml) を各チューブに個別に添加し、25 °C で保存しました。対照チューブには蒸留水 (50 ml) のみを使用しました。死んだ幼生は、潜伏期間 (12 ～ 48 時間) 中に泳ぐ兆候を示さなかったものとみなされました 87 。方程式を使用して幼虫の死亡率のパーセンテージを計算します。(1)88．
オドントテルミ科には、農業キャンパス (インドのアンナマライ大学) の腐った丸太の中で発見されたインドシロアリ Odontotermes obesus が含まれます。通常の手順を使用してこの生物界面活性剤 (0 ～ 50 mg/ml) をテストし、有害かどうかを判断します。層流空気流中で 30 分間乾燥させた後、ワットマン紙の各ストリップを 30、40、または 50 mg/ml の濃度の生物界面活性剤でコーティングしました。プレコートされた紙ストリップとコートされていない紙ストリップをペトリ皿の中央でテストし、比較しました。各ペトリ皿には約 30 匹の活動的なシロアリ O. obesus が含まれています。対照シロアリと試験シロアリには、食料源として湿った紙が与えられました。全てのプレートはインキュベーション期間中室温に保たれた。シロアリは 12、24、36、48 時間後に死亡しました89,90。次に、式 1 を使用して、さまざまな生物界面活性剤濃度におけるシロアリの死亡率を推定しました。(2)。
サンプルは氷上に保管され、100 ml の 0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.4) を含むマイクロチューブに詰められ、ラジブ ガンジー水産養殖センター (RGCA) の中央水産養殖病理学研究所 (CAPL) に送られました。組織学研究所、シルカリ、メイラドゥトゥライ。さらなる分析のために、インド、タミル・ナドゥ州の地区。サンプルは直ちに 4% パラホルムアルデヒド中で 37°C で 48 時間固定されました。
固定段階の後、材料を 0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.4) で 3 回洗浄し、エタノールで段階的に脱水し、LEICA 樹脂に 7 日間浸漬しました。次に、この物質を樹脂と重合剤で満たされたプラスチックの型に置き、物質を含むブロックが完全に重合するまで 37°C に加熱したオーブンに置きます。
重合後、ＬＥＩＣＡ ＲＭ２２３５ミクロトーム（Ｒａｎｋｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ １０，３９９ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｄｒ．Ｄａｖｉｓｂｕｒｇ，ＭＩ ４８，３５０，ＵＳＡ）を使用してブロックを３ｍｍの厚さに切断した。セクションはスライド上にグループ化されており、スライドごとに 6 つのセクションがあります。スライドを室温で乾燥させ、次にヘマトキシリンで７分間染色し、流水で４分間洗浄した。さらに、エオシン溶液を皮膚に5分間塗布し、流水で5分間洗い流します。
急性毒性は、さまざまな熱帯レベルの水生生物、96 時間の魚類 LC50、48 時間の D. magna LC50、および 96 時間の緑藻類 EC50 を使用して予測されました。魚および緑藻に対するラムノリピド生物界面活性剤の毒性は、米国環境保護庁によって開発された Windows 用 ECOSAR ソフトウェア バージョン 2.2 を使用して評価されました。(https://www.epa.gov/tsca-screening-tools/ecological-struct-activity-relationships-ecosar-predictive-model からオンラインで入手可能)。
殺幼虫および抗シロアリ活性に関するすべての試験は 3 回実行されました。幼虫およびシロアリの死亡率データの非線形回帰 (用量応答変数の対数) を実行して、致死濃度中央値 (LC50) を 95% 信頼区間で計算し、濃度応答曲線は Prism® (バージョン 8.0、GraphPad Software) Inc. を使用して生成しました。米国）84、91。
本研究は、Enterobacter cloacae SJ2 によって産生される微生物バイオサーファクタントの、蚊の幼虫駆除剤および防蟻剤としての可能性を明らかにしており、この研究は、幼虫駆除および防蟻作用のメカニズムのより深い理解に貢献するであろう。バイオサーファクタントで処理された幼虫の組織学的研究では、消化管、中腸、大脳皮質への損傷および腸上皮細胞の過形成が示されました。結果： Enterobacter cloacae SJ2 によって産生されるラムノリピド生物界面活性剤の抗シロアリおよび殺幼虫活性の毒性学的評価により、この分離株が蚊 (Cx quinquefasciatus) およびシロアリ (O. obesus) の媒介媒介疾患を制御するための潜在的な生物農薬であることが明らかになりました。生物界面活性剤の根底にある環境毒性とその潜在的な環境への影響を理解する必要があります。この研究は、生物界面活性剤の環境リスクを評価するための科学的根拠を提供します。
投稿時間: 2024 年 4 月 9 日