合成農薬の広範な使用は、耐性菌の出現、環境の悪化、人体への健康被害など、多くの問題を引き起こしています。そのため、新たな微生物農薬人の健康と環境に安全なバイオサーファクタントが緊急に必要とされています。この研究では、Enterobacter cloacae SJ2が産生するラムノリピドバイオサーファクタントを用いて、蚊（Culex quinquefasciatus）とシロアリ（Odontotermes obesus）の幼虫に対する毒性を評価しました。結果は、処理間で用量依存的な死亡率があることを示しました。シロアリと蚊の幼虫に対するバイオサーファクタントの48時間後のLC50（50％致死濃度）値は、非線形回帰曲線フィッティング法を使用して決定しました。結果、バイオサーファクタントの幼虫駆除および抗シロアリ活性の48時間LC50値（95％信頼区間）は、それぞれ26.49 mg/L（範囲25.40～27.57）、33.43 mg/L（範囲31.09～35.68）でした。組織病理学的検査の結果、バイオサーファクタント処理は、幼虫およびシロアリの細胞小器官組織に深刻な損傷を与えました。本研究の結果は、Enterobacter cloacae SJ2が産生する微生物バイオサーファクタントが、Cx防除に優れた、潜在的に効果的なツールとなる可能性を示唆しています。quinquefasciatusおよびO. obesus。
熱帯諸国では、多数の蚊媒介性疾患が発生しています1。蚊媒介性疾患の関連性は広範囲にわたります。毎年40万人以上がマラリアで亡くなっており、一部の大都市ではデング熱、黄熱病、チクングニア熱、ジカ熱などの深刻な疾患が流行しています2。世界中で感染症の6分の1に媒介性疾患が関連しており、最も深刻な症例は蚊によるものです3,4。イエカ、ハマダラカ、ヤブカは、疾患の伝播に最もよく関連する3種の蚊の属です5。ネッタイシマカによって媒介されるデング熱の蔓延は、過去10年間で増加しており、公衆衛生上の重大な脅威となっています4,7,8。世界保健機構 (WHO) によると、世界人口の 40% 以上がデング熱のリスクにさらされており、100 か国以上で毎年 5,000 万～ 1 億人の新規症例が発生しています9,10,11。デング熱は世界中で発生率が上昇しているため、大きな公衆衛生問題となっています12,13,14。アフリカハマダラカとして知られる Anopheles gambiae は、熱帯および亜熱帯地域におけるヒトマラリアの最も重要なベクターです15。ウエストナイルウイルス、セントルイス脳炎、日本脳炎、および馬と鳥のウイルス感染症は、イエカ属の蚊 (イエカ属) によって媒介されます。さらに、この蚊は細菌性および寄生虫性疾患の媒介者でもあります16。世界には 3,000 種を超えるシロアリが存在し、1 億 5,000 万年以上前から存在しています17。ほとんどの害虫は土壌に生息し、セルロースを含む木材や木材製品を餌とします。インドシロアリ（Odontotermes obesus）は、重要な作物や植林木に深刻な被害をもたらす重要な害虫です18。農業地域では、様々な段階でのシロアリの侵入により、様々な作物、樹種、建築資材に甚大な経済的損害が生じる可能性があります。また、シロアリは人体にも健康被害をもたらす可能性があります19。
今日の製薬および農業分野における微生物および害虫の耐性問題は複雑です20,21。そのため、両社は費用対効果の高い新しい抗菌剤と安全な生物農薬を模索する必要があります。現在市販されている合成農薬は、感染性があり、非標的益虫を撃退することが示されています22。近年、バイオサーファクタントは様々な産業で応用されているため、その研究が拡大しています。バイオサーファクタントは、農業、土壌浄化、石油抽出、細菌および昆虫の除去、食品加工において非常に有用かつ不可欠です23,24。バイオサーファクタントまたは微生物界面活性剤は、沿岸生息地や油汚染地域に生息する細菌、酵母、真菌などの微生物によって生成されるバイオサーファクタント化学物質です25,26。化学的に誘導された界面活性剤とバイオサーファクタントは、自然環境から直接得られる2つのタイプです27。様々なバイオサーファクタントが海洋生息地から得られます28,29。そのため、科学者たちは天然細菌をベースとしたバイオサーファクタント製造のための新たな技術を模索しています30,31。こうした研究の進歩は、これらの生物学的化合物が環境保護にとって重要であることを示しています32。バチルス、シュードモナス、ロドコッカス、アルカリゲネス、コリネバクテリウムといった細菌属は、よく研究されている代表的な細菌です23,33。
バイオサーファクタントには多くの種類があり、幅広い用途があります34。これらの化合物の大きな利点は、抗菌、殺虫、幼虫駆除活性を有するものがあることです。これは、農業、化学、製薬、化粧品業界で使用できることを意味します35,36,37,38。バイオサーファクタントは一般に生分解性で環境に優しいため、作物を保護するための総合的病害虫管理プログラムで使用されています39。このようにして、Enterobacter cloacae SJ2によって生成される微生物バイオサーファクタントの幼虫駆除および抗シロアリ活性に関する基礎知識が得られました。私たちは、異なる濃度のラムノリピドバイオサーファクタントに曝露したときの死亡率と組織学的変化を調べました。さらに、微細藻類、ミジンコ、および魚類に対する急性毒性を決定するために、広く使用されている定量的構造活性（QSAR）コンピュータプログラムである生態学的構造活性（ECOSAR）を評価しました。
本研究では、精製バイオサーファクタントの濃度を30～50 mg/ml（5 mg/ml間隔）の範囲で変化させ、インドシロアリ（O. obesus）および4種（Cx）に対する抗シロアリ活性（毒性）を試験した。評価対象は、Cx齢の幼虫。蚊（quinquefasciatus）の幼虫。O. obesusおよびCx. solanacearumに対するバイオサーファクタントの48時間LC50濃度。蚊の幼虫は、非線形回帰曲線フィッティング法を用いて同定した。結果は、バイオサーファクタント濃度の上昇に伴いシロアリの死亡率が増加することを示した。結果：バイオサーファクタントは幼虫駆除活性（図1）とシロアリ駆除活性（図2）を示し、48時間LC50値（95% CI）はそれぞれ26.49 mg/L（25.40～27.57）、33.43 mg/L（図31.09～35.68）でした（表1）。急性毒性（48時間）に関しては、バイオサーファクタントは試験対象生物に対して「有害」と分類されました。本研究で製造されたバイオサーファクタントは、曝露後24～48時間以内に100%の死亡率を示す優れた幼虫駆除活性を示しました。
幼虫駆除活性のLC50値を計算します。相対死亡率（％）に対する非線形回帰曲線（実線）と95％信頼区間（網掛け部分）。
シロアリ防除活性のLC50値を計算します。相対死亡率（％）に対する非線形回帰曲線（実線）と95％信頼区間（網掛け部分）。
実験終了時に、顕微鏡下で形態学的変化と異常を観察しました。対照群と処理群において、40倍の倍率で形態学的変化が観察されました。図3に示すように、バイオサーファクタント処理を受けた幼虫の大部分で成長障害が見られました。図3aは正常なCx. quinquefasciatus、図3bは異常なCx. quinquefasciatusの線虫幼虫5匹を示しています。
亜致死量（LC50）のバイオサーファクタントがイエカ（Culex quinquefasciatus）の幼虫の発育に及ぼす影響。光学顕微鏡写真（a）は正常なイエカの40倍拡大像。（b）異常なイエカの幼虫。5匹の線虫幼虫を発生させる。
本研究では、処理した幼虫（図4）およびシロアリ（図5）の組織学的検査により、腹部面積の縮小、筋肉、上皮層、皮膚の損傷など、いくつかの異常が明らかになった。中腸。組織学的検査により、本研究で使用したバイオサーファクタントの阻害活性のメカニズムが明らかになった。
正常な未処理の4齢Cx幼虫の組織病理学。quinquefasciatus幼虫（対照：(a,b)）とバイオサーファクタント処理（処理：(c,d)）。矢印は処理した腸管上皮（epi）、核（n）、および筋肉（mu）を示す。バー＝50µm。
未処理の正常なO. obesus（対照群：(a,b)）とバイオサーファクタント処理群（処理群：(c,d)）の組織病理学。矢印はそれぞれ腸管上皮（epi）と筋（mu）を示す。バー＝50µm。
本研究では、ラムノリピド系バイオサーファクタント製品の一次生産者（緑藻類）、一次消費者（ミジンコ）、および二次消費者（魚類）に対する急性毒性を予測するためにECOSARが用いられました。このプログラムは、分子構造に基づいて毒性を評価するために、洗練された定量的構造活性化合物モデルを用いています。このモデルは、構造活性（SAR）ソフトウェアを用いて、水生生物種に対する物質の急性毒性および長期毒性を計算します。具体的には、表2は、いくつかの生物種における推定平均致死濃度（LC50）および平均有効濃度（EC50）をまとめたものです。疑われる毒性は、化学物質の分類および表示に関する世界調和システム（GHS）に基づいて4段階に分類されました（表3）。
媒介性疾患、特に蚊やネッタイシマカの駆除。エジプト人にとって、現在困難な作業となっている40,41,42,43,44,45,46。ピレスロイドや有機リン系殺虫剤などの化学的に利用可能な殺虫剤は、ある程度の有益性があるものの、糖尿病、生殖障害、神経障害、癌、呼吸器疾患など、人体への重大なリスクをもたらす。さらに、時間の経過とともに、これらの昆虫はそれらに耐性を獲得する可能性がある13,43,48。したがって、効果的で環境に優しい生物学的防除策が、蚊の駆除においてより一般的な方法となるだろう49,50。ベネリ51は、都市部では蚊媒介生物の早期駆除がより効果的であると示唆したが、農村部では幼虫駆除剤の使用を推奨しなかった52。トムら53はまた、蚊は制御剤に対してより敏感であるため、未成熟段階で制御するのが安全で簡単な戦略であると示唆した54。
強力な菌株（Enterobacter cloacae SJ2）によるバイオサーファクタント生産は、一貫して有望な有効性を示しました。私たちの以前の研究では、Enterobacter cloacae SJ2が物理化学的パラメータを用いてバイオサーファクタント生産を最適化することが報告されています26。その研究によると、潜在的なE. cloacae分離株によるバイオサーファクタント生産の最適条件は、36時間培養、150 rpmでの撹拌、pH 7.5、37 °C、塩分1 ppt、炭素源として2%グルコース、1%酵母でした。抽出物を窒素源として使用し、2.61 g/Lのバイオサーファクタントが得られました。さらに、TLC、FTIR、MALDI-TOF-MSを用いてバイオサーファクタントの特性評価を行いました。これにより、ラムノリピドがバイオサーファクタントであることが確認されました。糖脂質バイオサーファクタントは、他の種類のバイオサーファクタントの中で最も集中的に研究されているクラスです55。これらは炭水化物と脂質、主に脂肪酸鎖から構成されています。糖脂質の中で代表的なものは、ラムノリピドとソホロリピドです56。ラムノリピドは、モノ-またはジ-β-ヒドロキシデカン酸に結合した2つのラムノース構造を有しています57。ラムノリピドは、医療・製薬業界での使用が確立されており58、近年では殺虫剤としても使用されています59。
バイオサーファクタントが呼吸管の疎水性領域と相互作用することで、水が気孔を通過できるようになり、幼虫と水生環境との接触が増加する。バイオサーファクタントの存在は、水面近くまで伸びる気管にも影響を及ぼすため、幼虫が水面に這い上がって呼吸しやすくなる。その結果、水の表面張力が低下する。幼虫は水面に付着できないため、水槽の底に落ち、静水圧が乱れ、過剰なエネルギー消費と溺死につながる38,60。Ghribi61 も同様の結果を得ており、Bacillus subtilis によって産生されたバイオサーファクタントが、Ephestia kuehniella に対する殺幼虫活性を示した。同様に、Cx. Das と Mukherjee23 は、環状リポペプチドが quinquefasciatus の幼虫に及ぼす影響も評価しました。
本研究の結果は、ラムノリピド バイオサーファクタントの Cx に対する殺幼虫活性に関するものです。 quinquefasciatus 蚊の殺害は、以前に発表された結果と一致しています。たとえば、バチルス属のさまざまな細菌によって生成されるサーファクチンベースのバイオサーファクタントが使用されます。 および Pseudomonas spp. いくつかの初期の報告書64,65,66 では、Bacillus subtilis23 由来のリポペプチド バイオサーファクタントの幼虫殺害活性が報告されています。 Deepali ら 63 は、Stenotropomonas maltophilia から単離されたラムノリピド バイオサーファクタントが 10 mg/L の濃度で強力な殺幼虫活性を示したことを発見しました。 Silva ら 67 は、ラムノリピド バイオサーファクタントが 1 g/L の濃度で Ae に対して殺幼虫活性を示したことを報告しました。 68 は、枯草菌（Bacillus subtilis）が産生するリポペプチド系バイオサーファクタントが、ユーカリの親油性画分を用いてイエカ（Culex）の幼虫とシロアリの死亡率を全体的に高めたと報告した。同様に、Masendraら 69 は、ユーカリの粗抽出物の親油性n-ヘキサン画分と酢酸エチル画分を用いて、働きアリ（Cryptotermes cynocephalus Light.）の死亡率が61.7%であったと報告した。
Parthipanら70は、枯草菌A1株およびシュードモナス・スタッツェリNA3株が産生するリポペプチド型バイオサーファクタントを、マラリア原虫マラリア原虫の媒介生物であるハマダラカ（Anopheles Stephensi）に対する殺虫剤として使用したことを報告した。彼らは、異なる濃度のバイオサーファクタントで処理した場合、幼虫と蛹の生存期間が長くなり、産卵期間が短縮し、不妊となり、寿命が短くなることを観察しました。枯草菌バイオサーファクタントA1のLC50値は、幼虫の異なる状態（I期、II期、III期、IV期、蛹期）でそれぞれ3.58、4.92、5.37、7.10、7.99 mg/Lでした。比較すると、Pseudomonas stutzeri NA3の幼虫期I～IVおよび蛹期のバイオサーファクタント濃度はそれぞれ2.61、3.68、4.48、5.55、6.99 mg/Lであった。生存幼虫および蛹のフェノロジーが遅れたのは、殺虫剤処理によって引き起こされた重大な生理学的および代謝的撹乱の結果であると考えられる71。
Wickerhamomyces anomalus 株 CCMA 0358 は、Aedes 属蚊に対して 100% の幼虫駆除効果を持つバイオサーファクタントを生産します。aegypti の 24 時間間隔 38 は、Silva らの報告よりも高かったです。ヒマワリ油を炭素源として Pseudomonas aeruginosa から生産されたバイオサーファクタントは、48 時間以内に 100% の幼虫を殺すことが示されています 67 。Abinaya ら72 と Pradhan ら73 も、Bacillus 属のいくつかの分離株が生産するサーファクタントの幼虫駆除効果または殺虫効果を実証しました。Senthil-Nathan らによる以前発表された研究では、植物ラグーンに曝露された蚊の幼虫は 100% 死ぬ可能性が高いことがわかりました 74。
致死量/濃度未満の殺虫剤では昆虫は死なないが、生物学的特徴を阻害することで将来の世代の昆虫の個体数を減少させる可能性があるため、昆虫の生物学に対する殺虫剤の致死的影響を評価することは、総合的病害虫管理プログラムにとって重要である10。Siqueira ら75 は、ラムノリピド バイオサーファクタント (300 mg/ml) を 50～300 mg/ml のさまざまな濃度で試験したところ、幼虫に対する完全な殺幼虫活性 (死亡率 100%) を確認した。ネッタイシマカの幼虫期。彼らは、死亡までの時間と致死濃度未満の濃度が幼虫の生存と遊泳活動に及ぼす影響を分析した。さらに、致死濃度未満のバイオサーファクタント (例: 50 mg/mL および 100 mg/mL) に 24～48 時間曝露した後、遊泳速度が低下することを観察した。致死量未満で有望な役割を持つ毒物は、曝露された害虫に複数の損傷を与えるのにより効果的であると考えられる76。
我々の研究結果の組織学的観察から、Enterobacter cloacae SJ2 が産生するバイオサーファクタントが、蚊（Cx. quinquefasciatus）およびシロアリ（O. obesus）の幼虫の組織を著しく変化させることが示された。バジル油製剤によって同様の異常が An. gambiaes.s および An. arabica に引き起こされたことが Ochola77 によって報告されている。Kamaraj ら78 もまた、An. Stephanie の幼虫に同様の形態学的異常が見られたことを報告している。金ナノ粒子に曝露された幼虫。Vasantha-Srinivasan ら79 もまた、ナズナの精油が Aedes albopictus および Aedes aegypti の房室および上皮層に深刻なダメージを与えたと報告している。Raghavendran らは、蚊の幼虫を現地のペニシリウム菌の菌糸抽出物 500 mg/ml で処理したことを報告している。 Ae は重度の組織学的損傷を示します。 aegypti および Cx。死亡率 80。以前、Abinaya らは An の 4 齢幼虫を研究しました。Stephensi と Ae. aegypti は、B. licheniformis の菌体多糖類を投与した Aedes aegypti に、胃盲腸、筋萎縮、神経索神経節の損傷と混乱など、多数の組織学的変化を発見しました72。Raghavendran らによると、P. daleae 菌糸体抽出物を投与後、試験した蚊 (4 齢幼虫) の中腸細胞で、腸管腔の腫脹、細胞間内容物の減少、核の変性が見られました81。同じ組織学的変化がエキナセア葉抽出物を投与した蚊の幼虫で観察され、処理した化合物の殺虫能力を示唆しています50。
ECOSARソフトウェアの利用は国際的に認められています82。最新の研究では、ECOSARバイオサーファクタントの微細藻類（C. vulgaris）、魚類、ミジンコ（D. magna）に対する急性毒性は、国連が定義する「毒性」カテゴリーに該当することが示唆されています83。ECOSAR生態毒性モデルは、SARとQSARを用いて物質の急性毒性と長期毒性を予測し、有機汚染物質の毒性予測によく用いられています82,84。
パラホルムアルデヒド、リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）、および本研究で使用したその他のすべての化学物質は、インドの HiMedia Laboratories から購入しました。
バイオサーファクタントの生産は、唯一の炭素源として1%の原油を添加した滅菌ブッシュネル・ハース培地200mLを含む500mL三角フラスコで行った。Enterobacter cloacae SJ2の前培養物（1.4 × 104 CFU/ml）を接種し、オービタルシェーカーで37℃、200 rpmで7日間培養した。培養後、培養液を3400×g、4℃で20分間遠心分離することによりバイオサーファクタントを抽出し、得られた上清をスクリーニングに使用した。バイオサーファクタントの最適化手順および特性評価は、我々の以前の研究26から採用した。
イエカ（Culex quinquefasciatus）の幼虫は、インド・タミル・ナードゥ州パランチペタイにある海洋生物学高等研究センター（CAS）から入手しました。幼虫は脱イオン水を満たしたプラスチック容器で、27±2℃、12:12（明暗比）の光周期で飼育しました。蚊の幼虫には10%ブドウ糖溶液を給餌しました。
Culex quinquefasciatus の幼虫は、開放型および保護されていない浄化槽で発見されています。実験室で幼虫を識別し、培養するには、標準分類ガイドラインを使用してください85。幼虫駆除試験は、世界保健機関の勧告に従って実施されました86。SH。quinquefasciatus の 4 齢幼虫を、容量の 3 分の 2 の空気間隔を置いて 25 ml および 50 ml のグループに分け、密閉管に収集しました。バイオサーファクタント (0～50 mg/ml) を各管に個別に添加し、25 °C で保管しました。コントロール管には蒸留水 (50 ml) のみを使用しました。死亡した幼虫は、孵化期間中 (12～48 時間) に泳ぐ兆候を示さなかったものとみなしました87。次の式を使用して、幼虫の死亡率を計算します。(1)88。
Odontotermitidae 科には、インドシロアリ Odontotermes obesus が含まれます。これは、農業キャンパス (インドのアナマライ大学) の腐った丸太で見つかります。このバイオサーファクタント (0～50 mg/ml) を通常の手順でテストし、有害かどうかを判断します。層流で 30 分間乾燥させた後、Whatman 紙の各ストリップに 30、40、50 mg/ml の濃度のバイオサーファクタントをコーティングしました。コーティング済みおよびコーティングなしの紙ストリップをペトリ皿の中央でテストし、比較しました。各ペトリ皿には、約 30 匹の活動的なシロアリ O. obesus が含まれています。コントロールおよびテスト シロアリには、餌として湿った紙を与えました。すべてのプレートは、インキュベーション期間中、室温で保持しました。 （２）
サンプルは氷上で保存され、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）100mlが入ったマイクロチューブに詰められ、インド、タミル・ナードゥ州マイラドゥトゥライ県シルカリにあるラジブ・ガンディー水産養殖センター（RGCA）の中央水産養殖病理学研究所（CAPL）の組織学研究所に送付され、さらなる分析が行われた。サンプルは直ちに4%パラホルムアルデヒドで37℃、48時間固定された。
固定段階後、材料は0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）で3回洗浄し、エタノールで段階的に脱水した後、LEICA樹脂に7日間浸漬した。その後、材料を樹脂と重合剤を充填したプラスチック型に入れ、37℃に加熱したオーブンで材料を含むブロックが完全に重合するまで放置した。
重合後、LEICA RM2235ミクロトーム（Rankin Biomedical Corporation、10,399 Enterprise Dr. Davisburg、MI 48,350、米国）を用いてブロックを3mmの厚さに切断した。切片はスライド上に6枚ずつまとめ、1枚のスライドにまとめた。スライドは室温で乾燥させた後、ヘマトキシリンで7分間染色し、流水で4分間洗浄した。さらに、エオシン溶液を皮膚に5分間塗布し、流水で5分間洗い流した。
急性毒性は、熱帯の異なる水生生物を用いて予測されました。魚類96時間LC50、D. magna 48時間LC50、緑藻類96時間EC50です。ラムノリピド系バイオサーファクタントの魚類および緑藻類に対する毒性は、米国環境保護庁（EPA）が開発したWindows用ECOSARソフトウェア バージョン2.2を用いて評価されました。（https://www.epa.gov/tsca-screening-tools/ecological-struct-activity-relationships-ecosar-predictive-modelでオンラインで入手可能です。）
幼虫駆除活性およびシロアリ防除活性試験はすべて3回繰り返して実施した。幼虫およびシロアリの死亡率データについて非線形回帰（用量反応変数の対数）を行い、95%信頼区間で半数致死濃度（LC50）を算出した。濃度反応曲線はPrism®（バージョン8.0、GraphPad Software Inc.、米国）84, 91を用いて作成した。
本研究は、エンテロバクター・クロアカエSJ2が産生する微生物バイオサーファクタントが蚊の幼虫駆除剤およびシロアリ駆除剤として有効であることを示しており、本研究は幼虫駆除およびシロアリ駆除作用のメカニズムの理解を深める上で貢献すると考えられる。バイオサーファクタントを投与された幼虫の組織学的検査では、消化管、中腸、大脳皮質への損傷、および腸管上皮細胞の増殖が認められた。結果：エンテロバクター・クロアカエSJ2が産生するラムノリピドバイオサーファクタントの抗シロアリおよび幼虫駆除活性に関する毒性評価により、この分離株は蚊（Cx quinquefasciatus）およびシロアリ（O. obesus）の媒介性疾患の防除に有効な生物農薬となる可能性が示された。バイオサーファクタントの根底にある環境毒性と、それらが環境に及ぼす潜在的な影響について理解する必要がある。この研究は、バイオ界面活性剤の環境リスクを評価するための科学的根拠を提供します。
投稿日時: 2024年4月9日