合成農薬の広範な使用は、耐性菌の出現、環境悪化、人体への害など、多くの問題を引き起こしている。そのため、新たな微生物農薬ヒトの健康と環境に安全なバイオサーファクタントが緊急に必要とされている。本研究では、Enterobacter cloacae SJ2 が産生するラムノリピドバイオサーファクタントを用いて、蚊 (Culex quinquefasciatus) とシロアリ (Odontotermes obesus) の幼虫に対する毒性を評価した。結果は、処理間で用量依存的な死亡率があることを示した。シロアリと蚊の幼虫に対するバイオサーファクタントの 48 時間における LC50 (50% 致死濃度) 値は、非線形回帰曲線フィッティング法を用いて決定した。結果は、バイオサーファクタントの殺幼虫活性と抗シロアリ活性の 48 時間 LC50 値 (95% 信頼区間) がそれぞれ 26.49 mg/L (範囲 25.40 ～ 27.57) と 33.43 mg/L (範囲 31.09 ～ 35.68) であることを示した。組織病理学的検査によると、バイオサーファクタントによる処理は、幼虫とシロアリの細胞小器官組織に深刻な損傷を引き起こした。この研究の結果は、Enterobacter cloacae SJ2 によって産生される微生物バイオサーファクタントが、Cx. quinquefasciatus および O. obesus の制御に優れた潜在的に効果的なツールであることを示している。
熱帯諸国では、蚊媒介性疾患が多数発生しています1。蚊媒介性疾患の重要性は広範囲に及んでいます。毎年40万人以上がマラリアで死亡しており、一部の大都市ではデング熱、黄熱病、チクングニア熱、ジカ熱などの深刻な病気の流行が発生しています2。ベクター媒介性疾患は、世界中の感染症の6分の1に関連しており、最も深刻な症例は蚊によって引き起こされています3、4。Culex、Anopheles、Aedesは、病気の伝播に最も一般的に関連する3つの蚊の属です5。ネッタイシマカによって媒介される感染症であるデング熱の蔓延は、過去10年間で増加しており、公衆衛生上の重大な脅威となっています4、7、8。世界保健機関（WHO）によると、世界人口の40%以上がデング熱のリスクにさらされており、100カ国以上で年間5,000万～1億件の新規症例が発生している9,10,11。デング熱は世界的に発生率が増加しているため、公衆衛生上の大きな問題となっている12,13,14。一般的にアフリカアノフェレス蚊として知られるガンビアハマダラカは、熱帯および亜熱帯地域におけるヒトマラリアの最も重要な媒介蚊である15。ウエストナイルウイルス、セントルイス脳炎、日本脳炎、および馬や鳥のウイルス感染症は、一般的にイエカと呼ばれるイエカによって媒介される。さらに、イエカは細菌性疾患や寄生虫性疾患の媒介者でもある16。世界には3,000種以上のシロアリが存在し、1億5,000万年以上前から存在している17。ほとんどの害虫は土壌に生息し、セルロースを含む木材や木材製品を餌としています。インドシロアリ Odontotermes obesus は、重要な作物や植林木に深刻な被害を与える重要な害虫です18。農業地域では、さまざまな段階のシロアリの蔓延により、さまざまな作物、樹種、建築資材に莫大な経済的損害が発生する可能性があります。シロアリは人間の健康問題を引き起こすこともあります19。
今日の医薬品および農業分野における微生物および害虫の耐性の問題は複雑である20,21。したがって、両社は新しい費用対効果の高い抗菌剤および安全な生物農薬を探す必要がある。合成農薬は現在入手可能であり、感染性があり、非標的の有益な昆虫を忌避することが示されている22。近年、バイオサーファクタントの研究は、さまざまな産業での応用により拡大している。バイオサーファクタントは、農業、土壌浄化、石油抽出、細菌および昆虫の除去、食品加工において非常に有用かつ不可欠である23,24。バイオサーファクタントまたは微生物サーファクタントは、沿岸生息地および油汚染地域で細菌、酵母、真菌などの微生物によって生成されるバイオサーファクタント化学物質である25,26。化学的に誘導された界面活性剤とバイオサーファクタントは、自然環境から直接得られる2つのタイプである27。さまざまなバイオサーファクタントが海洋生息地から得られる28,29。そのため、科学者たちは天然細菌をベースとしたバイオ界面活性剤の生産のための新しい技術を模索している30,31。このような研究の進歩は、これらの生物学的化合物が環境保護にとって重要であることを示している32。バチルス属、シュードモナス属、ロドコッカス属、アルカリゲネス属、コリネバクテリウム属などの細菌属は、よく研究されている代表例である23,33。
バイオサーファクタントにはさまざまな種類があり、用途も多岐にわたります34。これらの化合物の大きな利点は、抗菌、殺幼虫、殺虫活性を持つものがあることです。つまり、農業、化学、製薬、化粧品業界で使用できるということです35,36,37,38。バイオサーファクタントは一般的に生分解性があり、環境に有益であるため、作物を保護するための総合的害虫管理プログラムで使用されています39。このように、Enterobacter cloacae SJ2 によって産生される微生物バイオサーファクタントの殺幼虫活性とシロアリ駆除活性に関する基礎知識が得られています。ラムノリピドバイオサーファクタントのさまざまな濃度に曝露したときの死亡率と組織学的変化を調べました。さらに、微細藻類、ミジンコ、魚類に対する急性毒性を決定するために、広く使用されている定量的構造活性相関 (QSAR) コンピュータプログラムである生態学的構造活性相関 (ECOSAR) を評価しました。
この研究では、精製バイオサーファクタントの抗シロアリ活性（毒性）を、30～50 mg/ml（5 mg/ml間隔）のさまざまな濃度で、インドシロアリ、O. obesus、および第4種（評価対象）Cx. 幼虫、蚊の幼虫に対して試験した。O. obesusおよびCx. に対するバイオサーファクタントのLC50濃度を48時間にわたって測定した。蚊の幼虫は、非線形回帰曲線フィッティング法を使用して同定した。結果は、バイオサーファクタント濃度の増加に伴ってシロアリの死亡率が増加することを示した。結果によると、バイオサーファクタントは殺幼虫活性（図1）と抗シロアリ活性（図2）を有し、48時間LC50値（95%信頼区間）はそれぞれ26.49 mg/L（25.40～27.57）と33.43 mg/L（図31.09～35.68）であった（表1）。急性毒性（48時間）の観点から、バイオサーファクタントは試験対象生物に対して「有害」に分類される。本研究で製造されたバイオサーファクタントは、曝露後24～48時間以内に100%の死亡率を示し、優れた殺幼虫活性を示した。
殺幼虫活性のLC50値を計算します。相対死亡率（%）の非線形回帰曲線フィッティング（実線）と95%信頼区間（網掛け部分）。
シロアリ駆除活性のLC50値を計算します。相対死亡率（％）に対する非線形回帰曲線フィッティング（実線）と95％信頼区間（網掛け部分）。
実験終了後、顕微鏡下で形態変化と異常が観察された。形態変化は、対照群と処理群で40倍の倍率で観察された。図3に示すように、バイオサーファクタントで処理した幼虫の大部分で成長障害が発生した。図3aは正常なCx. quinquefasciatusを示し、図3bは異常なCx. quinquefasciatusの5匹の線虫の幼虫を示している。
亜致死量（LC50）のバイオサーファクタントがネッタイイエカ幼虫の発育に及ぼす影響。 (a) 40倍の倍率で撮影した正常なネッタイイエカの光学顕微鏡画像。 (b) 異常なネッタイイエカ。5匹の線虫幼虫を引き起こす。
本研究では、処理した幼虫（図4）とシロアリ（図5）の組織学的検査により、腹部面積の減少、筋肉、上皮層、皮膚の損傷、中腸の損傷など、いくつかの異常が明らかになった。組織学的検査により、本研究で使用したバイオサーファクタントの阻害活性のメカニズムが明らかになった。
正常な未処理の4齢Cx.quinquefasciatus幼虫（対照：（a、b））とバイオサーファクタント処理した幼虫（処理：（c、d））の組織病理像。矢印は、処理された腸上皮（epi）、核（n）、および筋肉（mu）を示す。スケールバー＝50 µm。
正常な未処理のO. obesus（対照：（a、b））とバイオサーファクタント処理したO. obesus（処理：（c、d））の組織病理像。矢印はそれぞれ腸上皮（epi）と筋肉（mu）を示す。スケールバー＝50 µm。
本研究では、ECOSARを用いて、ラムノリピドバイオサーファクタント製品の一次生産者（緑藻）、一次消費者（ミジンコ）、二次消費者（魚類）に対する急性毒性を予測した。このプログラムは、高度な定量的構造活性化合物モデルを用いて、分子構造に基づいて毒性を評価する。このモデルは、構造活性相関（SAR）ソフトウェアを用いて、水生生物に対する物質の急性および長期毒性を計算する。具体的には、表2に、いくつかの種について推定された平均致死濃度（LC50）と平均有効濃度（EC50）をまとめた。疑われる毒性は、化学物質の分類および表示に関する世界調和システム（GHS）を用いて4つのレベルに分類した（表3）。
蚊やネッタイシマカなどの媒介性疾患の制御。エジプト人は今や困難な仕事40,41,42,43,44,45,46。ピレスロイドや有機リン系殺虫剤などの化学的に利用可能な殺虫剤の中には、ある程度有益なものもあるが、糖尿病、生殖障害、神経障害、癌、呼吸器疾患など、人間の健康に重大なリスクをもたらす。さらに、これらの昆虫は時間の経過とともにそれらに耐性を持つようになる可能性がある13,43,48。したがって、効果的で環境に優しい生物的防除対策が、蚊の制御のより一般的な方法になるだろう49,50。ベネリ51は、蚊媒介生物の早期制御は都市部でより効果的であると示唆したが、農村部での幼虫駆除剤の使用は推奨しなかった52。トムら53も、蚊の幼虫段階での制御は、制御剤に感受性が高いため、安全で簡単な戦略であると示唆した54。
強力な菌株（Enterobacter cloacae SJ2）によるバイオサーファクタントの生産は、一貫して有望な有効性を示した。我々の以前の研究では、Enterobacter cloacae SJ2が物理化学的パラメータを使用してバイオサーファクタントの生産を最適化することが報告されている26。彼らの研究によると、潜在的なE. cloacae分離株によるバイオサーファクタント生産の最適条件は、36時間のインキュベーション、150 rpmでの撹拌、pH 7.5、37 °C、塩分濃度1 ppt、炭素源として2%のグルコース、1%の酵母であった。抽出物を窒素源として使用して、2.61 g/Lのバイオサーファクタントを得た。さらに、バイオサーファクタントはTLC、FTIR、およびMALDI-TOF-MSを使用して特性評価された。これにより、ラムノリピドがバイオサーファクタントであることが確認された。糖脂質バイオサーファクタントは、他のタイプのバイオサーファクタントの中で最も集中的に研究されているクラスである55。これらは炭水化物と脂質部分、主に脂肪酸鎖から構成されています。糖脂質の中では、ラムノ脂質とソホロ脂質が主な代表例です56。ラムノ脂質は、モノまたはジ-β-ヒドロキシデカン酸に結合した2つのラムノース部分を含んでいます57。ラムノ脂質は医療および製薬業界で広く利用されており58、最近では殺虫剤としても使用されています59。
バイオサーファクタントと呼吸管の疎水性領域との相互作用により、水が気孔腔を通過することが可能になり、幼虫と水生環境との接触が増加します。バイオサーファクタントの存在は、気管にも影響を与えます。気管の長さは表面に近いため、幼虫が表面に這い上がって呼吸しやすくなります。その結果、水の表面張力が低下します。幼虫は水面に付着できないため、水槽の底に沈み、静水圧が乱れ、過剰なエネルギー消費と溺死につながります38,60。同様の結果はGhribi61によっても得られており、Bacillus subtilisによって産生されたバイオサーファクタントがEphestia kuehniellaに対して殺幼虫活性を示しました。同様に、Cx. DasとMukherjee23は、環状リポペプチドがネッタイイエカ幼虫に及ぼす影響も評価した。
この研究の結果は、ラムノリピドバイオサーファクタントのCx.に対する殺幼虫活性に関するものです。 quinquefasciatus蚊の殺虫は、以前に発表された結果と一致しています。 例えば、Bacillus属およびPseudomonas属の様々な細菌によって産生されるサーファクチンベースのバイオサーファクタントが使用されています。 いくつかの初期の報告64,65,66では、Bacillus subtilis23由来のリポペプチドバイオサーファクタントの殺幼虫活性が報告されています。 Deepaliら63は、Stenotropomonas maltophiliaから分離されたラムノリピドバイオサーファクタントが10 mg/Lの濃度で強力な殺幼虫活性を持つことを発見しました。 Silvaら67は、ラムノリピドバイオサーファクタントのAeに対する殺幼虫活性が1 g/Lの濃度で報告されています。 Aedes aegypti。 Kanakdandeら68は、バチルス・サブチリスによって産生されるリポペプチドバイオサーファクタントが、ユーカリの親油性画分によってイエカの幼虫とシロアリに全体的な死亡率を引き起こしたと報告した。同様に、Masendraら69は、E.粗抽出物の親油性n-ヘキサン画分と酢酸エチル画分で働きアリ（Cryptotermes cynocephalus Light.）の死亡率が61.7%であったと報告した。
Parthipan ら 70 は、マラリア原虫 Plasmodium の媒介昆虫である Anopheles Stephensi に対する Bacillus subtilis A1 および Pseudomonas stutzeri NA3 によって産生されるリポペプチドバイオサーファクタントの殺虫効果を報告した。彼らは、バイオサーファクタントの異なる濃度で処理した場合、幼虫と蛹の生存期間が長くなり、産卵期間が短くなり、不妊になり、寿命が短くなることを観察した。B. subtilis バイオサーファクタント A1 の観察された LC50 値は、幼虫の異なる段階 (すなわち、幼虫 I、II、III、IV 段階および蛹段階) に対して、それぞれ 3.58、4.92、5.37、7.10、および 7.99 mg/L であった。それに対し、Pseudomonas stutzeri NA3の幼虫期I～IV期および蛹期のバイオサーファクタント濃度は、それぞれ2.61、3.68、4.48、5.55、6.99 mg/Lであった。生存した幼虫および蛹のフェノロジーの遅延は、殺虫剤処理によって引き起こされる重大な生理学的および代謝的障害の結果であると考えられている71。
Wickerhamomyces anomalus株CCMA 0358は、ネッタイシマカに対して100%の殺幼虫活性を持つバイオサーファクタントを産生する。24時間間隔38は、Silvaらによって報告されたものよりも高かった。ヒマワリ油を炭素源として用いてPseudomonas aeruginosaから産生されたバイオサーファクタントは、48時間以内に幼虫の100%を殺すことが示されている67。Abinayaら72およびPradhanら73も、Bacillus属のいくつかの分離株によって産生された界面活性剤の殺幼虫効果または殺虫効果を実証した。Senthil-Nathanらによる以前に発表された研究では、植物ラグーンに曝露された蚊の幼虫の100%が死ぬ可能性が高いことがわかった74。
殺虫剤の亜致死効果を昆虫の生物学に対して評価することは、総合的害虫管理プログラムにとって重要です。なぜなら、亜致死量/濃度では昆虫は死なないが、生物学的特性を阻害することで将来の世代の昆虫の個体数を減少させる可能性があるからです10。Siqueiraら75は、ラムノリピドバイオサーファクタント（300 mg/ml）を50～300 mg/mlのさまざまな濃度で試験したところ、完全な殺幼虫活性（100%死亡）が観察されました。ネッタイシマカの幼虫段階。彼らは、死亡までの時間と亜致死濃度が幼虫の生存と遊泳活動に及ぼす影響を分析しました。さらに、バイオサーファクタントの亜致死濃度（例えば、50 mg/mLと100 mg/mL）に24～48時間曝露した後、遊泳速度が低下することを観察しました。有望な亜致死効果を持つ毒物は、曝露された害虫に複数の損傷を与えるのに効果的であると考えられています76。
我々の結果の組織学的観察によると、Enterobacter cloacae SJ2 によって産生されるバイオサーファクタントは、蚊 (Cx. quinquefasciatus) とシロアリ (O. obesus) の幼虫の組織を大きく変化させる。同様の異常は、An. gambiaes.s と An. arabica のバジルオイル製剤によっても引き起こされ、Ochola77 によって報告されている。Kamaraj ら 78 も、金ナノ粒子に曝露された An. Stephanie の幼虫に同じ形態異常が見られたことを報告している。Vasantha-Srinivasan ら 79 も、ナズナ精油が Aedes albopictus の腔と上皮層をひどく損傷したことを報告している。Aedes aegypti。Raghavendran らは、蚊の幼虫を地元の Penicillium 菌の 500 mg/ml 菌糸体抽出物で処理したことを報告している。 Ae は重度の組織学的損傷を示します。 aegypti と Cx 。死亡率は 80 です。以前、Abinaya らは An の第 4 齢幼虫を研究しました。Stephensi と Ae. aegypti は、B. licheniformis 外多糖類で処理した Aedes aegypti に、胃盲腸、筋肉萎縮、神経索神経節の損傷と構造の乱れなど、多数の組織学的変化を発見しました 72。Raghavendran らによると、P. daleae 菌糸体抽出物で処理した後、試験した蚊 (第 4 齢幼虫) の中腸細胞は、腸管腔の膨張、細胞間内容物の減少、核の変性を示しました 81。エキナセア葉抽出物で処理した蚊の幼虫でも同じ組織学的変化が観察され、処理した化合物の殺虫効果が示されました 50。
ECOSARソフトウェアの使用は国際的に認められています82。現在の研究では、ECOSARバイオサーファクタントの微細藻類（C. vulgaris）、魚類、ミジンコ（D. magna）に対する急性毒性は、国連が定義する「毒性」カテゴリーに該当することが示唆されています83。ECOSAR生態毒性モデルは、SARとQSARを使用して物質の急性および長期毒性を予測し、有機汚染物質の毒性を予測するためによく使用されます82,84。
パラホルムアルデヒド、リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）、および本研究で使用したその他のすべての化学物質は、インドのHiMedia Laboratories社から購入した。
バイオサーファクタントの生産は、唯一の炭素源として1%の原油を添加した200 mLの滅菌ブッシュネルハース培地を含む500 mL三角フラスコで行われた。Enterobacter cloacae SJ2（1.4 × 10⁴ CFU/ml）の前培養液を接種し、37℃、200 rpmで7日間、軌道振とう機で培養した。培養期間後、培養培地を4℃で20分間3400×gで遠心分離することによりバイオサーファクタントを抽出し、得られた上清をスクリーニング目的で使用した。バイオサーファクタントの最適化手順と特性評価は、我々の以前の研究26から採用した。
ネッタイイエカの幼虫は、インド、タミル・ナードゥ州パランチペタイにある海洋生物学先端研究センター（CAS）から入手した。幼虫は、脱イオン水を満たしたプラスチック容器に入れ、27±2℃、明暗周期12時間：12時間で飼育した。蚊の幼虫には10%グルコース溶液を与えた。
開放型で保護されていない浄化槽で、ネッタイイエカの幼虫が発見されています。標準的な分類ガイドラインを使用して、実験室で幼虫を識別および培養します85。殺幼虫試験は、世界保健機関の勧告に従って実施されました86。SH。ネッタイイエカの4齢幼虫を、容量の3分の2の空気ギャップを持つ25 mlと50 mlのグループに分け、密閉チューブに収集しました。バイオサーファクタント（0～50 mg/ml）を各チューブに個別に添加し、25 °Cで保存しました。対照チューブには蒸留水（50 ml）のみを使用しました。死んだ幼虫は、培養期間（12～48時間）中に泳ぐ兆候を示さなかったものとみなしました87。式（1）を使用して、幼虫の死亡率を計算します88。
オドントテルミティ科には、インドのアナマライ大学農業キャンパスの腐った丸太で見つかったインドシロアリ Odontotermes obesus が含まれます。通常の手順を使用してこのバイオサーファクタント (0～50 mg/ml) をテストし、有害かどうかを判断します。層流空気流で 30 分間乾燥させた後、各ワットマン紙片に 30、40、または 50 mg/ml の濃度のバイオサーファクタントを塗布しました。塗布済みおよび未塗布の紙片をペトリ皿の中央でテストし、比較しました。各ペトリ皿には、約 30 匹の活動的な O. obesus シロアリが含まれています。対照および試験シロアリには、餌として湿った紙を与えました。すべてのプレートは、培養期間中ずっと室温で保管しました。シロアリは 12、24、36、および 48 時間後に死亡しました 89,90。次に、式 1 を使用して、異なるバイオサーファクタント濃度でのシロアリの死亡率を推定しました。(2)
サンプルは氷上で保管され、100 mlの0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）を含むマイクロチューブに詰められ、さらなる分析のために、インド、タミル・ナードゥ州、マイラドゥトゥライ地区、シルカリにあるラジブ・ガンジー水産養殖センター（RGCA）の中央水産養殖病理学研究所（CAPL）に送られた。サンプルは直ちに37℃で48時間、4%パラホルムアルデヒドで固定された。
固定後、試料を0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）で3回洗浄し、エタノールで段階的に脱水した後、ライカ樹脂に7日間浸漬した。次に、樹脂と重合剤を充填したプラスチック型に試料を入れ、37℃に加熱したオーブンに入れ、試料を含むブロックが完全に重合するまで放置した。
重合後、ブロックはLEICA RM2235ミクロトーム（Rankin Biomedical Corporation 10,399 Enterprise Dr. Davisburg, MI 48350, USA）を用いて厚さ3 mmに切断した。切片はスライド上にグループ化され、1枚のスライドに6枚の切片が含まれる。スライドは室温で乾燥させた後、ヘマトキシリンで7分間染色し、流水で4分間洗浄した。さらに、皮膚にエオシン溶液を5分間塗布し、流水で5分間すすいだ。
急性毒性は、熱帯の異なる水域に生息する水生生物を用いて予測されました。具体的には、96時間魚類LC50、48時間オオミジンコLC50、および96時間緑藻EC50です。ラムノリピドバイオサーファクタントの魚類および緑藻類に対する毒性は、米国環境保護庁が開発したWindows版ECOSARソフトウェアバージョン2.2を用いて評価されました（https://www.epa.gov/tsca-screening-tools/ecological-struct-activity-relationships-ecosar-predictive-model でオンラインで入手可能）。
殺幼虫活性および抗シロアリ活性のすべての試験は3回繰り返して実施された。幼虫およびシロアリの死亡率データの非線形回帰（用量反応変数の対数）を実行して、95%信頼区間の半数致死濃度（LC50）を計算し、Prism®（バージョン8.0、GraphPad Software）Inc.、米国）84、91を使用して濃度反応曲線を作成した。
本研究では、Enterobacter cloacae SJ2 が産生する微生物バイオサーファクタントが蚊の幼虫駆除剤およびシロアリ駆除剤として有望であることが明らかになり、この研究は、幼虫駆除作用およびシロアリ駆除作用のメカニズムの理解を深めることに貢献するだろう。バイオサーファクタントで処理した幼虫の組織学的研究では、消化管、中腸、大脳皮質の損傷、および腸上皮細胞の過形成が示された。結果: Enterobacter cloacae SJ2 が産生するラムノリピドバイオサーファクタントのシロアリ駆除活性および幼虫駆除活性の毒性学的評価により、この分離株は蚊 (Cx quinquefasciatus) およびシロアリ (O. obesus) の媒介性疾患の制御のための潜在的な生物農薬であることが明らかになった。バイオサーファクタントの根本的な環境毒性および潜在的な環境影響を理解する必要がある。本研究は、バイオ界面活性剤の環境リスクを評価するための科学的根拠を提供するものである。
投稿日時：2024年4月9日
