この研究では、市販の殺虫剤の致死性、亜致死性、毒性を評価した。シペルメトリン市販のシペルメトリン製剤を無尾両生類のオタマジャクシに投与した。急性試験では、100～800 μg/Lの濃度で96時間試験した。慢性試験では、天然に存在するシペルメトリン濃度（1、3、6、20 μg/L）で死亡率を試験し、続いて7日間の小核試験と赤血球の核異常試験を実施した。市販のシペルメトリン製剤のオタマジャクシに対するLC50は273.41 μg L−1であった。慢性試験では、最高濃度（20 μg L−1）で試験したオタマジャクシの半数が死亡し、50%を超える死亡率となった。小核試験では、6 μg L−1と20 μg L−1で有意な結果を示し、いくつかの核異常が検出されたことから、市販のシペルメトリン製剤はP. gracilisに対して遺伝毒性を示す可能性がある。シペルメトリンは本種にとって高いリスクがあり、短期的にも長期的にも複数の問題を引き起こし、生態系の動態に影響を及ぼす可能性があることを示唆しています。したがって、市販のシペルメトリン製剤はP. gracilisに毒性作用を有すると結論付けられます。
農業活動の継続的な拡大と、害虫駆除対策として、水生動物は農薬に頻繁に曝露されます1,2。農地周辺の水資源の汚染は、両生類などの非標的生物の発育や生存に影響を及ぼす可能性があります。
両生類は、環境マトリックスの評価においてますます重要になっています。無尾類は、複雑なライフサイクル、幼生期の急速な成長速度、栄養段階、透過性の皮膚10,11、生殖における水への依存12、保護されていない卵11,13,14といった独自の特性から、環境汚染物質の優れた生物指標と考えられています。一般的に「しだれガエル」として知られるヒメミズガエル（Physalaemus gracilis）は、農薬汚染の生物指標種であることが示されています4,5,6,7,15。本種は、アルゼンチン、ウルグアイ、パラグアイ、ブラジルの静水域、保護区、または生息地の変動が激しい地域に生息しており1617、その広範な分布と様々な生息地への耐性により、IUCNの分類では安定していると考えられています18。
シペルメトリンに曝露された両生類では、オタマジャクシの行動、形態、生化学的変化23,24,25、死亡率および変態期間の変化、酵素変化、孵化率の低下24,25、活動亢進26、コリンエステラーゼ活性の阻害27、遊泳能力の変化7,28など、亜致死的影響が報告されています。しかしながら、両生類におけるシペルメトリンの遺伝毒性影響に関する研究は限られています。そのため、無尾類のシペルメトリンに対する感受性を評価することが重要です。
環境汚染は両生類の正常な成長と発達に影響を与えますが、最も深刻な悪影響は農薬への曝露によるDNAの遺伝的損傷です13。血球形態分析は、野生種に対する汚染と物質の潜在的毒性の重要な生物指標です29。微小核試験は、環境中の化学物質の遺伝毒性を決定するために最も一般的に使用されている方法の一つです30。これは迅速、効果的、かつ安価な方法であり、両生類などの生物の化学物質汚染の優れた指標であり31,32、遺伝毒性汚染物質への曝露に関する情報も提供します33。
この研究の目的は、微小核試験と生態学的リスク評価を使用して、市販のシペルメトリン製剤が小型の水生オタマジャクシに及ぼす毒性を評価することです。
試験の急性期に異なる濃度の市販シペルメトリンに曝露された P. gracilis オタマジャクシの累積死亡率 (%)。
慢性試験中にさまざまな濃度の市販シペルメトリンに曝露された P. gracilis オタマジャクシの累積死亡率 (%)。
観察された高い死亡率は、異なる濃度のシペルメトリン（6 μg/Lおよび20 μg/L）に曝露された両生類における遺伝毒性作用の結果であり、赤血球中の微小核（MN）および核異常の存在によって証明された。MNの形成は有糸分裂のエラーを示しており、染色体と微小管の結合不良、染色体の取り込みと輸送を担うタンパク質複合体の欠陥、染色体分離のエラー、DNA損傷修復のエラー38,39と関連しており、農薬誘発性の酸化ストレス40,41とも関連している可能性がある。評価したすべての濃度で、その他の異常も観察された。シペルメトリン濃度の上昇に伴い、赤血球の核異常は、最低用量（1 μg/L）および最高用量（20 μg/L）でそれぞれ5%および20%増加した。例えば、種のDNAの変化は、短期および長期の生存に深刻な影響を及ぼす可能性があり、個体数の減少、生殖適応度の変化、近親交配、遺伝的多様性の喪失、移動率の変化などにつながります。これらの要因はすべて、種の生存と維持に影響を与える可能性があります42,43。赤血球異常の形成は、細胞質分裂の阻害を示し、異常な細胞分裂（二核赤血球）を引き起こす可能性があります44,45。多葉核は、核膜が複数の葉を持つ突起です46。一方、他の赤血球異常は、核腎／ブレブ47など、DNA増幅に関連している可能性があります。無核赤血球の存在は、特に汚染された水において、酸素輸送の障害を示している可能性があります48,49。アポトーシスは細胞死を示します50。
シペルメトリンの遺伝毒性作用は、他の研究でも実証されている。Kabañaら51は、オドントフリヌス・アメリカヌス（Odontophrynus americanus）の細胞を高濃度シペルメトリン（5,000および10,000 μg L−1）に96時間曝露させたところ、微小核や二核細胞、アポトーシス細胞などの核変化が観察されたことを明らかにした。シペルメトリン誘導性アポトーシスは、P. biligonigerus52およびRhinella arenarum53でも検出された。これらの結果は、シペルメトリンが様々な水生生物に遺伝毒性作用を有すること、そしてMNおよびENAアッセイが両生類に対する亜致死作用の指標となり、毒物に曝露された在来種および野生個体群に適用できる可能性があることを示唆している12。
市販のシペルメトリンは、環境に対して高い環境ハザード（急性・慢性ともに）を示し、そのHQは米国環境保護庁（EPA）レベル54を超えており、環境中に存在すると種に悪影響を与える可能性があります。慢性リスク評価では、死亡率のNOECは3 μg L−1であり、水中の濃度が種にリスクをもたらす可能性があることが確認されました55。エンドスルファンとシペルメトリンの混合物に曝露されたR. arenarumの幼虫の致死NOECは、168時間後に500 μg L−1であり、この値は336時間後に0.0005 μg L−1に減少しました。著者らは、曝露時間が長いほど、種に有害な濃度が低くなることを示しました。また、NOEC値が同じ曝露時間のP. gracilisの値よりも高かったことも強調しておくことが重要です。これは、シペルメトリンに対する種の反応が種特異的であることを示しています。さらに、死亡率に関して、シペルメトリン曝露後のP. gracilisのCHQ値は64.67に達し、これは米国環境保護庁（EPA）が設定した基準値54を上回っており、R. arenarumの幼虫のCHQ値もこの値（336時間後CHQ > 388.00）よりも高く、研究対象の殺虫剤が複数の両生類種に高いリスクをもたらすことを示しています。P. gracilisが変態を完了するには約30日かかること56を考慮すると、研究対象のシペルメトリン濃度は、感染個体が早期に成虫期または生殖期に入るのを阻害することで、個体数の減少に寄与する可能性があると結論付けることができます。
小核およびその他の赤血球核異常に関する計算によるリスク評価において、CHQ値は14.92～97.00の範囲にあり、シペルメトリンが自然生息地においてもP. gracilisに対して潜在的な遺伝毒性リスクを有することを示唆しています。死亡率を考慮すると、P. gracilisが許容できる最大生体異物濃度は4.24μg/Lでした。しかし、1μg/Lという低濃度でも遺伝毒性効果が認められました。この事実は、異常個体数の増加57につながり、生息地における種の発達と繁殖に影響を与え、両生類の個体数の減少につながる可能性があります。
市販の殺虫剤シペルメトリンは、P. gracilis に対して高い急性毒性および慢性毒性を示した。小核や赤血球の核異常（特に鋸歯状核、葉状核、小胞核）の存在が示すように、毒性作用によるものと考えられる高い死亡率が観察された。さらに、研究対象種は急性および慢性の両方で環境リスクの増加を示した。これらのデータは、当研究グループによるこれまでの研究と組み合わせると、市販の異なるシペルメトリンの製剤であっても、P. gracilis のアセチルコリンエステラーゼ（AChE）およびブチリルコリンエステラーゼ（BChE）活性の低下と酸化ストレス58を引き起こし、遊泳活動の変化と口腔奇形59をもたらしたことが示され、市販のシペルメトリンはこの種に対して高い致死および亜致死毒性を有することを示した。 60の研究では、市販のシペルメトリン製剤が、他の9種類の殺虫剤と比較して、P. gracilisおよび同属の別の種（P. cuvieri）に対して最も毒性が強かったことが分かりました。これは、環境保護のために法的に認可された濃度のシペルメトリンは、高い死亡率と長期的な個体群減少をもたらす可能性があることを示唆しています。
環境中に存在する濃度は、P. gracilisに高い死亡率をもたらし、潜在的なリスクとなる可能性があるため、両生類に対するこの殺虫剤の毒性を評価するには、更なる研究が必要です。特にブラジル産の種については、両生類に関するデータが不足しているため、これらの種に関する研究を奨励する必要があります。
慢性毒性試験は静置条件下で168時間（7日間）実施し、亜致死濃度は1、3、6、20μg ai L-1とした。両実験とも、処理群あたりオタマジャクシ10匹を6回反復して評価し、濃度ごとに合計60匹のオタマジャクシを用いた。一方、水のみの投与群は陰性対照とした。各実験装置は、容量500mlの滅菌ガラスシャーレで構成され、オタマジャクシ1匹/50mlの密度であった。フラスコは蒸発を防ぐためポリエチレンフィルムで覆い、継続的に通気した。
水の化学分析を行い、0、96、168時間後の農薬濃度を測定した。Sabinら 68 およびMartinsら 69 によれば、分析はサンタマリア連邦大学の農薬分析研究所（LARP）において、ガスクロマトグラフィーと三連四重極質量分析計（Varian model 1200、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて行われた。水中の農薬の定量結果は補足資料（表SM1）に示されている。
小核試験（MNT）および赤血球核異常試験（RNA）では、各処置群から15匹のオタマジャクシを分析した。オタマジャクシは5%リドカイン（50mg g-170）で麻酔し、使い捨てヘパリン注射器を用いて心穿刺により血液サンプルを採取した。血液塗抹標本は滅菌顕微鏡スライド上に作製し、風乾後、100%メタノール（4℃）で2分間固定した後、暗所で10%ギムザ染色液を用いて15分間染色した。染色後、スライドは蒸留水で洗浄して余分な染色液を除去し、室温で乾燥させた。
MNおよびENAの存在を確認するため、オタマジャクシ1匹から少なくとも1000個の赤血球を、71倍の対物レンズを備えた100倍顕微鏡を使用して分析した。シペルメトリン濃度およびコントロールを考慮し、合計75,796個のオタマジャクシの赤血球を評価した。遺伝毒性は、CarrascoらおよびFenechらの方法38,72に従って、以下の核病変の頻度を測定することで分析した。(1)無核細胞:核のない細胞。(2)アポトーシス細胞:核の断片化、プログラム細胞死。(3)二核細胞:2つの核を持つ細胞。(4)核芽またはブレブ細胞:核膜の小さな突起を持つ核を持つ細胞、ブレブは微小核に類似したサイズ。(5)核溶解細胞:核の輪郭のみを持ち、内部物質がない細胞。 (6) ノッチ細胞：核に明らかな亀裂やノッチのある細胞（腎臓型核とも呼ばれる）、(7) 分葉細胞：前述の小胞よりも大きな核突起を持つ細胞、(8) 微小核細胞：核が凝縮し細胞質が縮小した細胞。これらの変化は陰性対照の結果と比較された。
急性毒性試験結果（LC50）は、GBasicソフトウェアとTSK-Trimmed Spearman-Karber法74を用いて解析した。慢性毒性試験データは、誤差正規性（Shapiro-Wilks）および等分散性（Bartlett）検定を事前に実施した。結果は一元配置分散分析（ANOVA）を用いて解析した。データ間の比較にはTukey検定を、投与群と陰性対照群間の比較にはDunnett検定を用いた。
LOECおよびNOECデータはダネット検定を用いて解析された。統計検定はStatistica 8.0ソフトウェア（StatSoft社）を用いて実施され、有意水準は95%（p < 0.05）であった。
投稿日時: 2025年3月13日