この研究では、市販の殺虫剤の致死性、亜致死性、および毒性を評価した。シペルメトリン両生類のオタマジャクシに対する製剤の毒性を調べた。急性試験では、100～800 μg/L の濃度を 96 時間試験した。慢性試験では、天然に存在するシペルメトリン濃度 (1、3、6、20 μg/L) で死亡率を試験し、続いて 7 日間小核試験と赤血球核異常を調べた。市販のシペルメトリン製剤のオタマジャクシに対する LC50 は 273.41 μg L−1 であった。慢性試験では、最高濃度 (20 μg L−1) で 50% を超える死亡率となり、試験したオタマジャクシの半分が死亡した。小核試験では、6 および 20 μg L−1 で有意な結果を示し、いくつかの核異常が検出されたことから、市販のシペルメトリン製剤は P. gracilis に対して遺伝毒性の可能性がある。シペルメトリンはこの種にとって高リスクであり、短期および長期的に複数の問題を引き起こし、この生態系の動態に影響を与える可能性があることを示している。したがって、市販のシペルメトリン製剤はP. gracilisに対して毒性作用を持つと結論づけることができる。
農業活動の継続的な拡大と集約的な利用により害虫駆除対策により、水生動物は頻繁に農薬にさらされます1,2。農地近くの水資源の汚染は、両生類などの非標的生物の発育と生存に影響を与える可能性があります。
両生類は、環境マトリックスの評価においてますます重要になってきています。無尾類は、複雑な生活環、幼生の急速な成長速度、栄養段階、透過性のある皮膚10,11、繁殖のための水への依存12、保護されていない卵11,13,14などの独自の特性により、環境汚染物質の優れた生物指標と考えられています。一般的に泣きガエルとして知られるコガエル（Physalaemus gracilis）は、農薬汚染の生物指標種であることが示されています4,5,6,7,15。この種は、アルゼンチン、ウルグアイ、パラグアイ、ブラジルの止水域、保護区域、または生息地が変化する区域に生息しており16,17、その広い分布とさまざまな生息地への耐性により、IUCN分類では安定していると考えられています18。
シペルメトリンに曝露された両生類では、オタマジャクシの行動、形態、生化学的変化23,24,25、死亡率と変態時間の変化、酵素の変化、孵化率の低下24,25、過活動26、コリンエステラーゼ活性の阻害27、遊泳能力の変化7,28など、亜致死的な影響が報告されている。しかし、両生類におけるシペルメトリンの遺伝毒性影響に関する研究は限られている。したがって、無尾両生類のシペルメトリンに対する感受性を評価することが重要である。
環境汚染は両生類の正常な成長と発達に影響を与えますが、最も深刻な悪影響は農薬への曝露によって引き起こされるDNAの遺伝的損傷です13。血球形態分析は、汚染と野生生物に対する物質の潜在的な毒性の重要なバイオインジケーターです29。小核試験は、環境中の化学物質の遺伝毒性を判定するために最も一般的に使用されている方法の1つです30。これは、両生類などの生物の化学汚染の良好な指標となる迅速で効果的かつ安価な方法であり31,32、遺伝毒性汚染物質への曝露に関する情報を提供できます33。
本研究の目的は、小核試験および生態リスク評価を用いて、市販のシペルメトリン製剤が小型水生オタマジャクシに対して示す毒性の可能性を評価することであった。
試験の急性期に市販のシペルメトリンを異なる濃度で投与されたP. gracilisオタマジャクシの累積死亡率（％）。
慢性試験中に市販のシペルメトリンを異なる濃度で曝露させたP. gracilisオタマジャクシの累積死亡率（％）。
観察された高い死亡率は、赤血球に微小核（MN）および核異常が存在することから明らかなように、異なる濃度のシペルメトリン（6および20 μg/L）に曝露された両生類における遺伝毒性効果の結果である。MNの形成は有糸分裂のエラーを示し、染色体の微小管への結合不良、染色体の取り込みと輸送に関与するタンパク質複合体の欠陥、染色体分離のエラー、およびDNA損傷修復のエラー38,39に関連しており、殺虫剤誘発性の酸化ストレス40,41に関連している可能性がある。評価したすべての濃度で他の異常が観察された。シペルメトリン濃度の増加は、最低濃度（1 μg/L）および最高濃度（20 μg/L）でそれぞれ赤血球の核異常を5%および20%増加させた。例えば、種のDNAの変化は、短期および長期の生存に深刻な影響を及ぼし、個体数の減少、生殖適応度の変化、近親交配、遺伝的多様性の喪失、および移動率の変化を引き起こす可能性があります。これらの要因はすべて、種の生存と維持に影響を与える可能性があります42,43。赤血球異常の形成は、細胞分裂の阻害を示し、異常な細胞分裂（二核赤血球）を引き起こす可能性があります44,45。多葉核は、複数の葉を持つ核膜の突出です46。一方、他の赤血球異常は、核腎臓/ブレブなどのDNA増幅に関連している可能性があります47。無核赤血球の存在は、特に汚染された水では、酸素輸送の障害を示している可能性があります48,49。アポトーシスは細胞死を示します50。
他の研究でも、シペルメトリンの遺伝毒性効果が実証されている。Kabañaら51は、Odontophrynus americanus細胞を96時間高濃度のシペルメトリン（5000および10,000 μg L−1）に曝露した後、微小核や二核細胞、アポトーシス細胞などの核の変化が存在することを実証した。シペルメトリン誘発性アポトーシスは、P. biligonigerus52およびRhinella arenarum53でも検出された。これらの結果は、シペルメトリンがさまざまな水生生物に遺伝毒性効果を持ち、MNおよびENAアッセイが両生類に対する亜致死効果の指標となり、毒性物質に曝露された在来種および野生個体群に適用できる可能性があることを示唆している12。
シペルメトリンの市販製剤は、環境中に存在すると種に悪影響を及ぼす可能性のある米国環境保護庁（EPA）レベル54を超えるHQ値を有し、高い環境リスク（急性および慢性）をもたらします。慢性リスク評価では、死亡率のNOECは3 μg L−1であり、水中で検出された濃度が種にリスクをもたらす可能性があることが確認されました55。エンドスルファンとシペルメトリンの混合物に曝露されたR. arenarum幼虫の致死NOECは、168時間後に500 μg L−1でしたが、336時間後には0.0005 μg L−1に減少しました。著者らは、曝露時間が長くなるほど、種に有害な濃度が低くなることを示しました。また、NOEC値は同じ曝露時間でのP. gracilisの値よりも高かったことも強調しておく必要があります。これは、シペルメトリンに対する種の反応が種特異的であることを示しています。さらに、死亡率に関して言えば、シペルメトリンに曝露された後のP. gracilisのCHQ値は64.67に達し、これは米国環境保護庁が設定した基準値54よりも高く、R. arenarum幼虫のCHQ値もこの値よりも高かった（336時間後にCHQ > 388.00）。これは、調査対象の殺虫剤がいくつかの両生類種に高いリスクをもたらすことを示している。P. gracilisは変態を完了するのに約30日かかることを考慮すると56、調査対象のシペルメトリン濃度は、感染した個体が早期に成体または生殖段階に入るのを妨げることにより、個体数の減少に寄与する可能性があると結論付けられる。
計算された小核およびその他の赤血球核異常のリスク評価では、CHQ 値は 14.92 ～ 97.00 の範囲であり、シペルメトリンは自然生息地においても P. gracilis に対して潜在的な遺伝毒性リスクを有することが示された。死亡率を考慮すると、P. gracilis が許容できる異種化合物の最大濃度は 4.24 μg L−1 であった。しかし、1 μg/L という低濃度でも遺伝毒性効果が認められた。この事実は異常個体数の増加につながり、生息地における種の発達と繁殖に影響を与え、両生類個体群の減少につながる可能性がある。
市販の殺虫剤シペルメトリンは、P. gracilis に対して高い急性および慢性毒性を示した。微小核や赤血球核異常、特に鋸歯状核、葉状核、小胞状核の存在によって証明されるように、毒性作用によるものと考えられる高い死亡率が観察された。さらに、研究対象種は、急性および慢性の両方で環境リスクの増加を示した。これらのデータは、我々の研究グループによる以前の研究と合わせて、異なる市販のシペルメトリン製剤であっても、アセチルコリンエステラーゼ (AChE) およびブチリルコリンエステラーゼ (BChE) 活性の低下と酸化ストレス58を引き起こし、P. gracilis の遊泳活動の変化と口腔奇形59 をもたらし、市販のシペルメトリン製剤がこの種に対して高い致死毒性および亜致死毒性を有することを示している。Hartmann ら60の研究では、市販のシペルメトリン製剤が、他の9種類の殺虫剤と比較して、P. gracilisと、同じ属の別の種（P. cuvieri）に対して最も毒性が高いことがわかった。これは、環境保護のために法的に承認されたシペルメトリンの濃度が、高い死亡率と長期的な個体数減少をもたらす可能性があることを示唆している。
環境中に存在する濃度では高い死亡率を引き起こし、P. gracilisに潜在的なリスクをもたらす可能性があるため、殺虫剤の両生類に対する毒性を評価するには、さらなる研究が必要である。両生類、特にブラジル産の種に関するデータは乏しいため、両生類種に関する研究を奨励すべきである。
慢性毒性試験は静的条件下で 168 時間 (7 日間) 実施され、亜致死濃度は 1、3、6、20 μg ai L−1 であった。両実験とも、処理群ごとに 10 匹のオタマジャクシを 6 回繰り返し評価し、濃度ごとに合計 60 匹のオタマジャクシを用いた。一方、水のみの処理は陰性対照として用いた。各実験装置は、容量 500 ml の滅菌ガラス皿と、溶液 50 ml あたり 1 匹のオタマジャクシの密度で構成された。フラスコは蒸発を防ぐためにポリエチレン フィルムで覆われ、連続的に通気された。
0、96、168時間後の水質を化学分析し、農薬濃度を測定した。Sabinら68およびMartinsら69によると、分析はサンタマリア連邦大学の農薬分析研究所（LARP）で、ガスクロマトグラフィーとトリプル四重極質量分析計（Varianモデル1200、米国カリフォルニア州パロアルト）を用いて実施された。水中の農薬の定量結果は補足資料（表SM1）に示されている。
小核試験（MNT）および赤血球核異常試験（RNA）については、各処理群から15匹のオタマジャクシを分析対象とした。オタマジャクシは5%リドカイン（50 mg/g）で麻酔し、使い捨てヘパリン処理済み注射器を用いて心臓穿刺により採血した。血液塗抹標本を滅菌顕微鏡スライド上に作製し、風乾後、100%メタノール（4℃）で2分間固定し、その後、暗所で10%ギムザ染色液で15分間染色した。染色後、スライドを蒸留水で洗浄して余分な染色液を除去し、室温で乾燥させた。
各オタマジャクシから少なくとも 1000 個の赤血球を 71 対物レンズを備えた 100 倍顕微鏡で分析し、MN および ENA の存在を判定した。オタマジャクシから合計 75,796 個の赤血球が、シペルメトリン濃度と対照を考慮して評価された。遺伝毒性は、Carrasco らおよび Fenech らの方法 38,72 に従って、次の核病変の頻度を決定することによって分析された: (1) 無核細胞: 核のない細胞; (2) アポトーシス細胞: 核断片化、プログラムされた細胞死; (3) 二核細胞: 2 つの核を持つ細胞; (4) 核芽またはブレブ細胞: 核膜の小さな突起、微小核と同様のサイズのブレブを持つ核を持つ細胞; (5) 核溶解細胞: 内部物質がなく核の輪郭のみを持つ細胞; （６）ノッチ細胞：核の形状に明らかな亀裂やノッチがある細胞で、腎臓形核とも呼ばれる。（７）小葉状細胞：前述の小胞よりも大きな核突起を持つ細胞。（８）微小細胞：核が凝縮し、細胞質が減少した細胞。これらの変化は、ネガティブコントロールの結果と比較された。
急性毒性試験結果（LC50）は、GBasicソフトウェアとTSK-Trimmed Spearman-Karber法74を用いて解析した。慢性毒性試験データは、誤差の正規性（Shapiro-Wilks検定）と分散の均一性（Bartlett検定）について事前に検定した。結果は一元配置分散分析（ANOVA）を用いて解析した。データ間の比較にはTukey検定を、治療群と陰性対照群間の比較にはDunnett検定を用いた。
LOECおよびNOECデータは、ダネット検定を用いて解析した。統計検定は、Statistica 8.0ソフトウェア（StatSoft社製）を用い、有意水準95%（p < 0.05）で実施した。
投稿日時：2025年3月13日
