コロンビアでは気候変動と変動性により米の生産が減少しています。植物成長調整剤熱ストレスは、様々な作物のストレスを軽減するための戦略として使用されてきました。したがって、本研究の目的は、複合熱ストレス（高昼夜温度）、キャノピー温度、相対水分含量にさらされた2つの市販イネ遺伝子の生理学的影響（気孔コンダクタンス、総クロロフィル含有量、Fv/Fm比）および生化学的変数（マロンジアルデヒド（MDA）およびプロリン酸含有量）を評価することでした。最初の実験と2番目の実験は、それぞれ2つのイネ遺伝子Federrose 67（「F67」）とFederrose 2000（「F2000」）の植物を使用して実施しました。両方の実験は、一連の実験としてまとめて分析されました。確立された処理は次のとおりです：絶対対照（AC）（最適温度（昼/夜温度30/25°C）で生育したイネ）、熱ストレス対照（SC）[複合熱ストレスのみにさらされたイネ（40/25°C）。熱ストレス下では、植物冠の温度が2～3℃低下し、植物体内のMDA含有量が減少する。相対耐性指数は、CK（97.69%）およびBR（60.73%）の葉面散布が、主にF2000イネにおける複合熱ストレスを軽減するのに役立つことを示しています。結論として、BRまたはCKの葉面散布は、複合熱ストレス条件がイネの生理行動に及ぼす悪影響を軽減するための農業戦略として考えられます。
イネ（Oryza sativa）はイネ科に属し、トウモロコシや小麦と並んで世界で最も多く栽培されている穀物の一つです（Bajaj and Mohanty, 2005）。イネの栽培面積は617,934ヘクタールで、2020年の国内生産量は2,937,840トン、平均収量は5.02トン/ヘクタールでした（Federarroz (Federación Nacional de Arroceros), 2021）。
地球温暖化は米の作物に影響を及ぼし、高温や干ばつの期間など、さまざまな種類の非生物的ストレスを引き起こしています。気候変動は世界の気温上昇を引き起こしており、21世紀には気温が1.0〜3.7°C上昇すると予測されており、熱ストレスの頻度と強度が増す可能性があります。環境温度の上昇は米に影響を与え、作物の収穫量が6〜7％減少しています。一方、気候変動は、熱帯および亜熱帯地域での深刻な干ばつや高温の期間など、作物にとって好ましくない環境条件ももたらします。さらに、エルニーニョなどの変動性イベントは熱ストレスを引き起こし、一部の熱帯地域での作物被害を悪化させる可能性があります。コロンビアでは、米生産地域の気温が2050年までに2〜2.5°C上昇すると予測されており、米の生産量を減少させ、市場やサプライチェーンへの製品の流れに影響を与えます。
ほとんどの稲作は、気温が作物の生育に最適な範囲に近い地域で栽培されています（Shah et al., 2011）。稲作の最適な平均昼夜気温は、稲の成長と発達熱ストレスの許容温度は、それぞれ通常28℃と22℃です（Kilasi et al., 2018; Calderón-Páez et al., 2021）。これらの閾値を超える気温は、イネの発育の敏感な段階（分げつ、開花、開花、登熟）で中度から重度の熱ストレスを引き起こし、穀粒収量に悪影響を及ぼす可能性があります。この収量減少は主に、植物生理に影響を及ぼす長期間の熱ストレスによるものです。ストレスの持続時間や到達した最高気温などのさまざまな要因の相互作用により、熱ストレスは植物の代謝と発育にさまざまな不可逆的な損傷を引き起こす可能性があります。
熱ストレスは、植物のさまざまな生理学的および生化学的プロセスに影響を及ぼします。イネにおいて、葉の光合成は熱ストレスの影響を最も受けやすいプロセスの一つです。日中の気温が35℃を超えると光合成速度が50%低下します。イネの生理学的反応は、熱ストレスの種類によって異なります。たとえば、植物が日中の高温（33～40℃）または昼夜ともに高温（日中は35～40℃、夜間は28～30℃）にさらされると、光合成速度と気孔コンダクタンスが抑制されます。（Cは夜を意味します）（Lü et al., 2013; Fahad et al., 2016; Chaturvedi et al., 2017）。夜間の高温（30℃）は、光合成を中程度に抑制しますが、夜間呼吸を増加させます（Fahad et al., 2016; Alvarado-Sanabria et al., 2017）。ストレス期間に関係なく、熱ストレスはイネの葉のクロロフィル含有量、クロロフィル可変蛍光と最大クロロフィル蛍光の比（Fv/Fm）、およびルビスコの活性化にも影響を及ぼします（Cao et al. 2009; Yin et al. 2010）。）Sanchez Reynoso et al.、2014。
生化学的変化は、植物の熱ストレスへの適応におけるもう一つの側面です (Wahid et al., 2007)。プロリン含量は、植物ストレスの生化学的指標として用いられてきました (Ahmed and Hassan 2011)。プロリンは炭素源または窒素源として、また高温条件下での膜安定剤として作用するため、植物の代謝において重要な役割を果たしています (Sánchez-Reinoso et al., 2014)。高温は脂質過酸化を介して膜の安定性にも影響を与え、マロンジアルデヒド (MDA) の形成につながります (Wahid et al., 2007)。そのため、MDA含量は、熱ストレス下における細胞膜の構造的完全性を理解するためにも用いられてきました (Cao et al., 2009; Chavez-Arias et al., 2018)。最後に、複合熱ストレス（37/30°C（昼/夜））により、米の電解質漏出率とマロンジアルデヒド含有量が増加しました（Liu et al.、2013）。
植物成長調整剤（GR）は、熱ストレスに対する植物の反応や生理学的防御機構に積極的に関与しているため、その使用は熱ストレスの悪影響を軽減するものとして評価されてきました（Peleg and Blumwald, 2011; Yin et al. et al., 2011; Ahmed et al., 2015）。遺伝資源の外因的利用は、様々な作物の熱ストレス耐性にプラスの効果をもたらしてきました。研究により、ジベレリン（GA）、サイトカイニン（CK）、オーキシン（AUX）、ブラシノステロイド（BR）などの植物ホルモンは、様々な生理学的および生化学的変数の増加をもたらすことが示されています（Peleg and Blumwald, 2011; Yin et al. Ren, 2011; Mitler et al., 2012; Zhou et al., 2014）。コロンビアでは、遺伝資源の外因的利用とそのイネ作物への影響は十分に理解されておらず、研究も進んでいません。しかしながら、過去の研究では、BRの葉面散布によってイネ幼植物の葉のガス交換特性、クロロフィルまたはプロリン含量が向上し、イネの耐性が向上する可能性があることが示されています（Quintero-Calderón et al., 2021）。
サイトカイニンは、熱ストレスを含む非生物的ストレスに対する植物の応答を媒介します（Ha et al., 2012）。さらに、CKの外因性施用が熱によるダメージを軽減できることが報告されています。例えば、ゼアチンの外因性施用は、熱ストレス下のクリーピングベントグラス（Agrotis estolonifera）の光合成速度、クロロフィルaおよびb含有量、電子伝達効率を増加させました（Xu and Huang, 2009; Jespersen and Huang, 2015）。また、ゼアチンの外因性施用は、抗酸化活性の向上、さまざまなタンパク質の合成の促進、植物組織における活性酸素種（ROS）によるダメージとマロンジアルデヒド（MDA）産生の減少も引き起こします（Chernyadyev, 2009; Yang et al., 2009）。
ジベレリン酸の使用は、熱ストレスに対する良好な反応も示しています。研究により、ジベレリン酸の生合成は様々な代謝経路を媒介し、高温条件下での耐性を高めることが示されています（Alonso-Ramirez et al. 2009; Khan et al. 2020）。Abdel-Nabi et al. (2020) は、外因性ジベレリン酸（25または50 mg/L）を葉面散布すると、熱ストレスを受けたオレンジ植物の光合成速度と抗酸化活性が対照植物と比較して向上することを発見しました。また、外因性ヒアルロン酸（HA）の施用により、熱ストレス下のナツメヤシ（Phoenix dactylifera）の相対水分含量、クロロフィルおよびカロテノイド含量が増加し、脂質過酸化が減少することも観察されています（Khan et al., 2020）。オーキシンは、高温条件への適応的成長反応を制御する上でも重要な役割を果たしている (Sun et al., 2012; Wang et al., 2016)。この成長調節因子は、非生物的ストレス下でのプロリン合成や分解などのさまざまなプロセスにおける生化学的マーカーとして機能する (Ali et al. 2007)。さらに、AUX は抗酸化活性を高め、脂質過酸化の減少により植物中の MDA の減少につながる (Bielach et al., 2017)。Sergeev et al. (2018) は、熱ストレス下のエンドウ (Pisum sativum) 植物で、プロリン - ジメチルアミノエトキシカルボニルメチル) ナフチルクロロメチルエーテル (TA-14) の含有量が増加することを観察した。同じ実験で、彼らはまた、AUX 処理した植物では処理していない植物と比較して MDA レベルが低いことも観察した。
ブラシノステロイドは、熱ストレスの影響を緩和するために用いられる別の種類の成長調節剤です。Ogwenoら (2008) は、外因性BR散布によって、熱ストレス下にあるトマト（Solanum lycopersicum）植物の純光合成速度、気孔コンダクタンス、およびルビスコカルボキシル化の最大速度が8日間にわたって上昇したと報告しています。エピブラシノステロイドの葉面散布は、熱ストレス下にあるキュウリ（Cucumis sativus）植物の純光合成速度を上昇させる可能性があります (Yuら, 2004)。さらに、外因性BR散布は、熱ストレス下にある植物のクロロフィル分解を遅らせ、水利用効率とPSII光化学反応の最大量子収率を向上させます (Holáら, 2010; Toussagunpanitら, 2015)。
気候変動と変動により、米作物は日中の気温が高い期間に直面します（Lesk et al., 2016; Garcés, 2020; Federarroz (Federación Nacional de Arroceros), 2021）。植物の表現型解析では、稲作地域の熱ストレスを緩和する戦略として植物栄養素または生物刺激剤の使用が研究されています (Alvarado-Sanabria et al., 2017; Calderón-Páez et al., 2021; Quintero-Calderón et al., 2021)。さらに、生化学的および生理学的変数（葉温、気孔コンダクタンス、クロロフィル蛍光パラメータ、クロロフィルおよび相対水分含量、マロンジアルデヒドおよびプロリン合成）の使用は、地域的および国際的に熱ストレス下にあるイネをスクリーニングするための信頼性の高いツールです（Sánchez-Reynoso et al.、2014年、Alvarado-Sanabria et al.、2017年、）。しかし、地域レベルでのイネの葉面植物ホルモン散布に関する研究は依然としてまれです。したがって、植物成長調整剤の施用の生理学的および生化学的反応の研究は、これに対する実用的な農業戦略を提案する上で非常に重要です。イネにおける複雑な熱ストレス期間の悪影響に対処します。したがって、本研究の目的は、4つの植物成長調整剤（AUX、CK、GA、およびBR）の葉面施用の生理学的（気孔コンダクタンス、クロロフィル蛍光パラメータ、相対水分含量）および生化学的影響を評価することです。 (光合成色素、マロンジアルデヒドおよびプロリン含有量) 複合熱ストレス (昼夜気温が高い) を受けた 2 つの市販米遺伝子型の変数。
本研究では、2つの独立した実験を行った。最初の実験では、フェダーローズ67（F67：過去10年間の高温下で開発された遺伝子型）とフェダーローズ2000（F2000：20世紀最後の10年間に開発された、白葉ウイルス耐性を示す遺伝子型）の種子がそれぞれ使用された。両遺伝子型はコロンビアの農家で広く栽培されている。種子は、有機物含有量2%の砂質ローム土壌を入れた10Lトレイ（長さ39.6cm、幅28.8cm、高さ16.8cm）に播種した。各トレイには、発芽前の種子を5粒ずつ植えた。パレットは、海抜（asl）2556メートルの高度にあるコロンビア国立大学ボゴタキャンパス農学部の温室（北緯43°50′56″、西経74°04′051″）に設置され、2019年10月から12月にかけて実施されました。2020年の同じ季節に、1つの実験（Federroz 67）と2番目の実験（Federroz 2000）が行われました。
各植え付け時期の温室内の環境条件は次のとおりです。昼夜温度 30/25°C、相対湿度 60~80%、自然光周期 12 時間 (光合成有効放射 1500 µmol (光子) m-2 s-)。正午に 1)。植物は、種子発芽後 (DAE) 20 日目に、Sánchez-Reinoso ら (2019) に従って各要素の含有量に応じて施肥されました。植物あたり窒素 670 mg、リン 110 mg、カリウム 350 mg、カルシウム 68 mg、マグネシウム 20 mg、硫黄 20 mg、ケイ素 17 mg。植物には、ホウ素 10 mg、銅 17 mg、亜鉛 44 mg が含まれています。各実験において、イネはフェノロジーステージV5に達した時点で最大47DAEまで維持されました。過去の研究では、このフェノロジーステージがイネの熱ストレス研究を行うのに適した時期であることが示されています（Sánchez-Reinoso et al., 2014; Alvarado-Sanabria et al., 2017）。
各実験では、葉成長調整剤を2回別々に散布した。最初の葉面植物ホルモン散布は、環境ストレスに対する植物の準備として、熱ストレス処理の5日前（42 DAE）に行われた。2回目の葉面散布は、植物がストレス条件にさらされてから5日後（52 DAE）に行われた。4種類の植物ホルモンが使用され、本研究で散布された各有効成分の特性は補足表1に記載されている。使用した葉成長調整剤の濃度は以下のとおりである：（i）濃度5×10−5 Mのオーキシン（1-ナフチル酢酸：NAA）、（ii）5×10−5 Mのジベレリン（ジベレリン酸：NAA）、GA3）。 (iii) サイトカイニン（トランスゼアチン）1×10-5 M (iv) ブラシノステロイド[スピロスタン-6-オン、3,5-ジヒドロキシ-、(3b,5a,25R)] 5×10-5; M。これらの濃度は、肯定的な反応を誘導し、熱ストレスに対する植物の抵抗性を高めるために選択された（Zahir et al., 2001; Wen et al., 2010; El-Bassiony et al., 2012; Salehifar et al., 2017 ）。植物成長調整剤を散布していないイネには、蒸留水のみを処理した。すべてのイネに手動噴霧器で散布した。葉の表裏が湿るように、植物に 20 ml の H2O を散布した。すべての葉面散布で、農業用補助剤（Agrotin、Bayer CropScience、コロンビア）を 0.1%（v/v）使用した。ポットと噴霧器の間の距離は30cmです。
各実験において、最初の葉面散布から5日後（47 DAE）に熱ストレス処理を施した。イネを温室から294 L栽培チャンバー（MLR-351H、米国イリノイ州サンヨー）に移し、熱ストレスを発生させるか、または同じ環境条件を維持した（47 DAE）。複合熱ストレス処理は、チャンバーを以下の昼夜温度に設定することにより実施した：日中の最高気温［40°Cで5時間（11:00～16:00）］、夜間［30°Cで5時間］。これを8日間連続（19:00～24:00）。ストレス温度および曝露時間は、過去の研究（Sánchez-Reynoso et al. 2014; Alvarado-Sanabría et al. 2017）に基づいて選択した。一方、生育室に移された植物群は、温室内で連続8日間、同じ温度（昼間30℃、夜間25℃）に保たれました。
実験終了時に、以下の処理グループが得られました: (i) 生育温度条件 + 蒸留水の施用 [絶対制御 (AC)]、(ii) 熱ストレス条件 + 蒸留水の施用 [熱ストレス制御 (SC)]、(iii) 熱ストレス条件 + オーキシン施用 (AUX)、(iv) 熱ストレス条件 + ジベレリン施用 (GA)、(v) 熱ストレス条件 + サイトカイニン施用 (CK)、および (vi) 熱ストレス条件 + ブラシノステロイド (BR) 付録。これらの処理グループは、2 つの遺伝子型 (F67 および F2000) に使用されました。すべての処理は、それぞれ 1 つの植物で構成される 5 回の反復による完全なランダム化設計で実行されました。各植物は、実験終了時に決定された変数を読み取るために使用されました。実験は 55 DAE 続きました。
気孔コンダクタンス（gs）は、ポータブルポロソメーター（SC-1、METER Group Inc.、米国）を用いて、0～1000 mmol m-2 s-1の範囲で測定しました。サンプルチャンバーの開口部は6.35 mmです。測定は、主茎が完全に展開した成熟葉に気孔コンダクタンス計のプローブを取り付けて行いました。各処理区において、11:00から16:00の間に各植物の葉3枚についてgsを測定し、平均値を算出しました。
RWCは、Ghoulamら（2002）の方法に従って測定した。gの測定に使用した完全に膨張したシートは、RWCの測定にも使用した。収穫直後にデジタルスケールを用いて新鮮重量（FW）を測定した。葉は水を満たしたプラスチック容器に入れ、暗所で室温（22℃）で48時間放置した。その後、デジタルスケールで重量を測定し、膨張重量（TW）を記録した。膨張した葉はオーブンで75℃で48時間乾燥させ、乾燥重量（DW）を記録した。
相対クロロフィル含量はクロロフィルメーター（atLeafmeter、FT Green LLC、米国）を用いて測定し、atLeaf単位で表した（Dey et al., 2016）。PSII最大量子効率（Fv/Fm比）は、連続励起クロロフィル蛍光計（Handy PEA、Hansatech Instruments、英国）を用いて記録した。Fv/Fm測定前に、葉をリーフクランプを用いて20分間暗順応させた（Restrepo-Diaz and Garces-Varon, 2013）。暗順応後、ベースライン（F0）および最大蛍光（Fm）を測定した。これらのデータから、変動蛍光（Fv = Fm – F0）、変動蛍光と最大蛍光の比（Fv/Fm）、PSII光化学反応の最大量子収率（Fv/F0）、およびFm/F0比が算出されました（Baker, 2008; Lee et al. ., 2017）。相対クロロフィル量とクロロフィル蛍光の測定値は、gs測定に使用したのと同じ葉で測定しました。
生化学的変数として、葉の生重量約800mgを採取した。葉サンプルは液体窒素中でホモジェナイズし、更なる分析のために保管した。組織中のクロロフィルa、b、およびカロテノイド含有量を推定するために使用した分光分析法は、Wellburn (1994) によって記載された方法と式に基づいている。葉組織サンプル（30mg）を採取し、80%アセトン3ml中でホモジェナイズした。その後、サンプルを遠心分離機（モデル420101、Becton Dickinson Primary Care Diagnostics、米国）で5000rpm、10分間かけて粒子を除去した。上清液に80%アセトンを加えて最終容量6mlに希釈した（Sims and Gamon, 2002）。分光光度計 (Spectronic BioMate 3 UV-vis、Thermo、米国) を使用して、クロロフィル含有量を 663 (クロロフィル a) および 646 (クロロフィル b) nm で、カロテノイド含有量を 470 nm で測定しました。
Hodgesら（1999）が報告したチオバルビツール酸（TBA）法を用いて、膜脂質過酸化（MDA）を評価した。葉組織約0.3gを液体窒素中でホモジェナイズした。サンプルは5000rpmで遠心分離し、分光光度計を用いて440、532、600nmの吸光度を測定した。最後に、吸光係数（157 M mL-1）を用いてMDA濃度を算出した。
すべての処理におけるプロリン含有量は、Batesら（1973）の方法を用いて測定した。保存サンプルに3%スルホサリチル酸水溶液10 mlを加え、Whatmanろ紙（No. 2）でろ過した。ろ液2 mlをニンヒドリック酸2 mlおよび氷酢酸2 mlと反応させた。混合物を90℃のウォーターバスに1時間置いた。氷上でインキュベートして反応を停止させた。ボルテックスシェーカーを用いてチューブを激しく振盪し、得られた溶液をトルエン4 mlに溶解した。光合成色素の定量に使用したのと同じ分光光度計（Spectronic BioMate 3 UV-Vis、Thermo、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて、520 nmの吸光度を測定した。
Gerhardsら（2016）によって記載された方法、キャノピー温度とCSIを計算します。熱写真は、ストレス期間の終了時に±2°Cの精度でFLIR 2カメラ（FLIR Systems Inc.、マサチューセッツ州ボストン、米国）で撮影されました。撮影のために植物の後ろに白い表面を置きます。ここでも、2つの工場を参照モデルと見なしました。植物は白い表面に置かれ、1つは農業用補助剤（Agrotin、Bayer CropScience、ボゴタ、コロンビア）でコーティングされ、すべての気孔が開いている状態（ウェットモード（Twet））をシミュレートし、もう1つは何も塗布していない葉（ドライモード（Tdry））でした（Castro-Duqueら、2020）。撮影中のカメラとポットの間の距離は1mでした。
相対耐性指数は、処理植物の気孔コンダクタンス（gs）を対照植物（ストレス処理なし、成長調整剤適用済み植物）と比較して間接的に計算し、本研究で評価した処理遺伝子型の耐性を判定しました。RTIは、Chávez-Arias et al. (2020) から改変した式を使用して取得しました。
各実験では、上記のすべての生理学的変数を、上層林冠から採取した完全に展開した葉を用いて55 DAEで測定・記録しました。また、植物が生育する環境条件の変化を避けるため、測定は生育チャンバー内で実施しました。
第1実験と第2実験のデータは、一連の実験としてまとめて分析されました。各実験群は5本の植物で構成され、各植物が実験単位を構成しました。分散分析（ANOVA）を実施しました（P ≤ 0.05）。有意差が検出された場合は、P ≤ 0.05でTukeyの事後比較検定を使用しました。パーセンテージ値を変換するには、アークサイン関数を使用してください。データはStatistix v 9.0ソフトウェア（Analytical Software、米国フロリダ州タラハシー）を使用して分析し、SigmaPlot（バージョン10.0、Systat Software、米国カリフォルニア州サンノゼ）を使用してプロットしました。研究対象となった最適な植物成長調整剤を特定するために、InfoStat 2016ソフトウェア（Analysis Software、アルゼンチン国立コルドバ大学）を使用して主成分分析を実施しました。
表1は、実験、様々な処理、そしてそれらが葉の光合成色素（クロロフィルa、b、総クロロフィル、カロテノイド）、マロンジアルデヒド（MDA）およびプロリン含量、そして気孔コンダクタンスとどのように相互作用するかを示した分散分析（ANOVA）の要約です。55 DAEにおけるイネのgs、相対水分含量（RWC）、クロロフィル含量、クロロフィルα蛍光パラメータ、樹冠温度（PCT）（°C）、作物ストレス指数（CSI）、および相対耐性指数の影響を示しています。
表 1. 実験 (遺伝子型) と熱ストレス処理間のイネの生理学的および生化学的変数に関する ANOVA データの要約。
実験と処理間の葉光合成色素相互作用、相対クロロフィル含量（Aleaf測定値）、およびα-クロロフィル蛍光パラメータの差（P≤0.01）を表2に示す。昼夜を問わず気温が高いと、総クロロフィルおよびカロテノイド含量が増加した。植物ホルモンを葉面散布していないイネ苗（「F67」で2.36 mg g-1、「F2000」で2.56 mg g-1）は、最適温度条件下で生育した植物（2.67 mg g-1）と比較して、総クロロフィル含量が低いことが示された。両実験において、「F67」は2.80 mg g-1、「F2000」は2.80 mg g-1であった。さらに、熱ストレス下でAUXとGAの併用散布を受けたイネ苗では、両遺伝子型においてクロロフィル含量の減少が認められた（「F67」ではAUX = 1.96 mg g-1、GA = 1.45 mg g-1、「F67」ではAUX = 1.96 mg g-1、GA = 1.45 mg g-1、「F2000」ではAUX = 2.24 mg g-1、GA = 1.43 mg g-1）。熱ストレス下において、BRの葉面散布は両遺伝子型においてクロロフィル含量のわずかな増加をもたらした。最後に、CK葉面散布は、すべての処理（AUX、GA、BR、SC、およびAC処理）の中で、遺伝子型F67（3.24 mg g-1）およびF2000（3.65 mg g-1）で最も高い光合成色素値を示しました。クロロフィル（Aleaf unit）の相対含有量も、複合熱ストレスによって減少しました。最高値は、両方の遺伝子型でCCを散布した植物でも記録されました（「F67」で41.66、「F2000」で49.30）。FvおよびFv/Fm比は、処理間および栽培品種間で有意な差を示しました（表2）。全体として、これらの変数の中で、栽培品種F67は栽培品種F2000よりも熱ストレスの影響を受けにくかったです。FvおよびFv/Fm比は、2回目の実験でより悪化しました。ストレスを受けた植物ホルモンを一切散布しなかった「F2000」苗は、Fv値（2120.15）とFv/Fm比（0.59）が最も低かったが、CKの葉面散布によりこれらの値は回復した（Fv：2591.89、Fv/Fm比：0.73）。最適温度条件下で生育した「F2000」植物で記録されたものと同様の測定値（Fv：2955.35、Fv/Fm比：0.73:0.72）を得た。初期蛍光（F0）、最大蛍光（Fm）、PSIIの最大光化学量子収率（Fv/F0）、およびFm/F0比に有意差はなかった。最後に、BRはCKで観察されたものと同様の傾向を示した（Fv 2545.06、Fv/Fm比0.73）。
表2。2種類のイネ遺伝子型[Federrose 67（F67）およびFederrose 2000（F2000）]の植物における出芽後55日（DAE）の葉の光合成色素[総クロロフィル（Chl Total）、クロロフィル a（Chl a）、クロロフィル b（Chl b）、およびカロテノイド Cx+c]、相対クロロフィル含有量（Atliff単位）、クロロフィル蛍光パラメータ（初期蛍光（F0）、最大蛍光（Fm）、可変蛍光（Fv）、最大PSII効率（Fv/Fm）、PSIIの光化学的最大量子収率（Fv/F0 ）、およびFm/F0）。
異なる処理をしたイネの相対水分含有量（RWC）は、実験処理と葉面処理の相互作用において差（P ≤ 0.05）を示した（図1A）。SAで処理した場合、両方の遺伝子型で最低値が記録された（F67で74.01％、F2000で76.6％）。熱ストレス条件下では、異なる植物ホルモンで処理した両方の遺伝子型のイネのRWCが大幅に増加した。全体として、CK、GA、AUX、またはBRの葉面散布は、実験中に最適条件下で生育した植物の値と同様のRWCを増加させた。絶対対照および葉面散布された植物では、両方の遺伝子型で約83％の値が記録された。一方、gsも実験と処理の相互作用において有意差（P ≤ 0.01）を示した（図1B）。絶対対照（AC）植物も各遺伝子型で最も高い値を記録しました（F67では440.65 mmol m-2s-1、F2000では511.02 mmol m-2s-1）。複合熱ストレスのみを受けたイネは、両遺伝子型で最も低いgs値を示しました（F67では150.60 mmol m-2s-1、F2000では171.32 mmol m-2s-1）。すべての植物成長調整剤の葉面散布もgを増加させました。CCを散布したF2000イネでは、植物ホルモンの葉面散布の効果がより顕著でした。この植物群は、絶対対照植物（AC 511.02、CC 499.25 mmol m-2s-1）と比較して差は見られませんでした。
図 1。複合熱ストレス (昼/夜 40°/30°C) が、出芽後 55 日 (DAE) における 2 つのイネ遺伝子型 (F67 および F2000) の相対水分含量 (RWC) (A)、気孔コンダクタンス (gs) (B)、マロンジアルデヒド (MDA) 生成 (C)、およびプロリン含量 (D) に及ぼす影響。各遺伝子型に対して評価した処理は、絶対制御 (AC)、熱ストレス制御 (SC)、熱ストレス + オーキシン (AUX)、熱ストレス + ジベレリン (GA)、熱ストレス + 細胞分裂促進因子 (CK)、および熱ストレス + ブラシノステロイド (BR) です。各列は、5 つのデータ ポイント (n = 5) の平均 ± 標準誤差を表します。列の後に異なる文字が続いている場合は、Tukey の検定によって統計的に有意な差があることを示します (P ≤ 0.05)。等号の付いた文字は、平均値が統計的に有意でないことを示します (≤ 0.05)。
MDA（P ≤ 0.01）およびプロリン（P ≤ 0.01）含有量も、実験と植物ホルモン処理の相互作用において有意差を示した（図1C、D）。SC処理では両遺伝子型において脂質過酸化の増加が観察された（図1C）。しかし、葉成長調整剤散布処理では両遺伝子型において脂質過酸化が減少した。一般的に、植物ホルモン（CA、AUC、BR、またはGA）の使用は脂質過酸化（MDA含有量）の減少につながる。 2つの遺伝子型のAC植物と、熱ストレス下および植物ホルモンを散布された植物との間に違いは見つかりませんでした（「F67」植物の観測されたFW値は4.38〜6.77µmol g-1の範囲であり、FW「F2000」植物の観測値は2.84〜9.18µmol g-1（植物）の範囲でした）。一方、「F67」植物のプロリン合成は、複合ストレス下の「F2000」植物よりも低く、プロリン生産の増加につながりました。熱ストレスを受けたイネでは、両方の実験において、これらのホルモンの投与により、F2000植物のアミノ酸含有量が大幅に増加することが観察されました（AUXとBRはそれぞれ30.44と18.34µmol g-1）（図1G）。
葉面への植物成長調整剤散布と複合熱ストレスが植物のキャノピー温度と相対耐性指数 (RTI) に及ぼす影響を図 2A と B に示します。両方の遺伝子型で、AC 植物のキャノピー温度は 27°C 近く、SC 植物は約 28°C でした。また、CK と BR の葉面処理では、SC 植物と比較してキャノピー温度が 2～3°C 低下することが観察されました (図 2A)。RTI は他の生理学的変数と同様の動作を示し、実験と処理の相互作用に有意差 (P ≤ 0.01) を示しました (図 2B)。SC 植物は、両方の遺伝子型で植物耐性が低かった (それぞれ「F67」イネと「F2000」イネで 34.18% と 33.52%)。植物ホルモンの葉面施肥は、高温ストレスにさらされた植物の RTI を改善します。この効果は、CCを散布した「F2000」植物でより顕著で、RTIは97.69でした。一方、葉面散布因子ストレス条件下では、イネの降伏応力指数（CSI）においてのみ有意差が認められました（P ≤ 0.01）（図2B）。複合熱ストレスを受けたイネのみが、最も高いストレス指数（0.816）を示しました。イネに様々な植物ホルモンを散布した場合、ストレス指数は低下しました（0.6～0.67）。最終的に、最適条件下で生育したイネの値は0.138でした。
図2。複合熱ストレス（昼夜40°/30°C）が2種の植物種のキャノピー温度（A）、相対耐性指数（RTI）（B）、および作物ストレス指数（CSI）（C）に及ぼす影響。市販のイネ遺伝子型（F67およびF2000）を異なる熱処理に供した。各遺伝子型で評価した処理は、絶対制御（AC）、熱ストレス制御（SC）、熱ストレス+オーキシン（AUX）、熱ストレス+ジベレリン（GA）、熱ストレス+細胞分裂促進因子（CK）、および熱ストレス+ブラシノステロイド（BR）であった。複合熱ストレスでは、イネを昼夜の高い気温（昼夜40°/30°C）にさらす。各列は5つのデータポイント（n = 5）の平均±標準誤差を表す。列の後に異なる文字が続いている部分は、Tukeyの検定による統計的に有意な差を示す（P ≤ 0.05）。等号の付いた文字は、平均値が統計的に有意ではないことを示します (≤ 0.05)。
主成分分析（PCA）により、55 DAEで評価した変数が、成長調整剤を散布した熱ストレスを受けたイネの生理学的および生化学的反応の66.1%を説明することが明らかになりました（図3）。ベクトルは変数を表し、点は植物成長調整剤（GR）を表します。gs、クロロフィル含有量、PSIIの最大量子効率（Fv/Fm）、および生化学的パラメータ（TChl、MDA、およびプロリン）のベクトルは、原点に対して近い角度にあり、植物の生理学的行動とそれらの間に高い相関関係があることを示しています。変数。1つのグループ（V）には、最適温度（AT）で生育したイネの苗と、CKおよびBAで処理したF2000植物が含まれていました。同時に、GRで処理した植物の大部分は別のグループ（IV）を形成し、F2000のGA処理は別のグループ（II）を形成しました。対照的に、植物ホルモンの葉面散布を行わなかった（両方の遺伝子型ともSC）熱ストレスを受けたイネの苗（グループIとIII）は、グループVとは反対の領域に位置しており、熱ストレスが植物生理に及ぼす影響を示しています。
図 3。出芽後 55 日 (DAE) における 2 つのイネ遺伝子型 (F67 および F2000) の植物に対する複合熱ストレス (昼/夜 40°C/30°C) の影響のバイグラフ分析。略語: AC F67、絶対制御 F67、SC F67、熱ストレス制御 F67、AUX F67、熱ストレス + オーキシン F67、GA F67、熱ストレス + ジベレリン F67、CK F67、熱ストレス + 細胞分裂、BR F67、熱ストレス + ブラシノステロイド。F67、AC F2000、絶対制御 F2000、SC F2000、熱ストレス制御 F2000、AUX F2000、熱ストレス + オーキシン F2000、GA F2000、熱ストレス + ジベレリン F2000。 CK F2000、熱ストレス + サイトカイニン、BR F2000、熱ストレス + 真鍮ステロイド、F2000。
クロロフィル含量、気孔コンダクタンス、Fv/Fm比、CSI、MDA、RTI、プロリン含量などの変数は、イネの遺伝子型の適応を理解し、熱ストレス下における農業戦略の影響を評価するのに役立ちます（Sarsu et al., 2018; Quintero-Calderon et al., 2021）。この実験の目的は、複雑な熱ストレス条件下でのイネ実生の生理学的および生化学的パラメータに対する4つの成長調整剤の施用の影響を評価することでした。実生検定は、利用可能なインフラの規模や状態に応じて、イネ植物を同時に評価するためのシンプルで迅速な方法です（Sarsu et al. 2018）。この研究の結果は、複合的な熱ストレスが2つのイネ遺伝子型で異なる生理学的および生化学的反応を引き起こし、適応プロセスを示していることを示しました。これらの結果はまた、葉面成長調整剤（主にサイトカイニンとブラシノステロイド）の散布が、主にgs、RWC、Fv/Fm比、光合成色素、プロリン含有量に影響を与えるため、複雑な熱ストレスに対するイネの適応を助けることを示しています。
成長調整剤の施用は、熱ストレス下にあるイネの水分状態の改善に役立ち、これはストレスの上昇と植物群落温度の低下と関連している可能性があります。本研究では、「F2000」（感受性遺伝子型）の植物において、CKまたはBRを主に処理したイネは、SCを主に処理した植物よりもgs値が高く、PCT値が低いことが示されました。以前の研究でも、gsとPCTは、イネの適応反応と農業戦略が熱ストレスに及ぼす影響を判断できる正確な生理学的指標であることが示されています（Restrepo-Diaz and Garces-Varon, 2013; Sarsu et al., 2018; Quintero -Carr DeLong et al., 2021）。葉のCKまたはBRはストレス下でgを高める。これは、これらの植物ホルモンがABA（非生物的ストレス下での気孔閉鎖の促進因子）などの他のシグナル伝達分子との合成相互作用を通じて気孔開口を促進できるためである（Macková et al., 2013; Zhou et al., 2013）。 2013）。 、2014）。気孔開口は葉の冷却を促進し、キャノピー温度の低下を助ける（Sonjaroon et al., 2018; Quintero-Calderón et al., 2021）。これらの理由から、CKまたはBRを散布されたイネのキャノピー温度は、複合熱ストレス下でより低くなる可能性がある。
高温ストレスは、葉の光合成色素含有量を減少させる可能性がある (Chen et al., 2017; Ahammed et al., 2018)。この研究では、イネが熱ストレス下にあり、植物成長調整剤を散布していない場合、光合成色素は両方の遺伝子型で減少する傾向があった (表 2)。Feng et al. (2013) も、熱ストレスにさらされた 2 つのコムギ遺伝子型の葉のクロロフィル含有量が大幅に減少したと報告している。高温にさらされるとクロロフィル含有量が減少することが多く、これはクロロフィル生合成の低下、色素の分解、または熱ストレス下でのそれらの複合効果による可能性がある (Fahad et al., 2017)。しかし、CK と BA を主に処理したイネでは、熱ストレス下で葉の光合成色素の濃度が増加した。同様の結果が Jespersen and Huang (2015) や Suchsagunpanit et al. によっても報告されている。 (2015) は、熱ストレスを受けたベントグラスとイネにそれぞれゼアチンとエピブラシノステロイドホルモンを施用した後、葉のクロロフィル含有量が増加することを観察しまし た。CK と BR が複合熱ストレス下で葉のクロロフィル含有量の増加を促進する理由に関する合理的な説明は、CK が (老化活性化プロモーター (SAG12) や HSP18 プロモーターなどの) 発現プロモーターの持続的誘導の開始を促進し、葉のクロロフィル損失を減らす可能性があるということです。 、葉の老化を遅らせ、植物の熱に対する耐性を高めます (Liu et al., 2020)。BR は、ストレス条件下でクロロフィル生合成に関与する酵素の合成を活性化または誘導することにより、葉のクロロフィルを保護し、葉のクロロフィル含有量を増加させることができます (Sharma et al., 2017; Siddiqui et al., 2018)。最後に、2 つの植物ホルモン (CK と BR) も熱ショックタンパク質の発現を促進し、クロロフィル生合成の増加など、さまざまな代謝適応プロセスを改善します (Sharma et al.、2017; Liu et al.、2020)。
クロロフィル a 蛍光パラメータは、非生物的ストレス条件に対する植物の耐性または適応を評価できる迅速かつ非破壊的な方法を提供します (Chaerle et al. 2007; Kalaji et al. 2017)。 Fv/Fm 比などのパラメータは、ストレス条件への植物の適応の指標として使用されています (Alvarado-Sanabria et al. 2017; Chavez-Arias et al. 2020)。 この研究では、SC 植物、主に「F2000」イネ植物がこの変数の最低値を示しました。 Yin et al. (2010) はまた、最も分げつが多いイネの葉の Fv/Fm 比が 35°C を超える温度で大幅に減少することを発見しました。 Feng et al. によると、 (2013)によれば、熱ストレス下におけるFv/Fm比の低下は、PSII反応中心による励起エネルギーの捕捉および変換速度の低下を示しており、熱ストレス下ではPSII反応中心が崩壊することを示唆している。この観察結果から、光合成装置の撹乱は、感受性品種（Fedearroz 2000）の方が耐性品種（Fedearroz 67）よりも顕著であると結論付けられる。
CKまたはBRの使用は、一般的に複合熱ストレス条件下でのPSIIのパフォーマンスを向上させました。 Suchsagunpanit et al. (2015) も同様の結果を得ており、イネにおいてBRの施用により熱ストレス下でのPSIIの効率が向上することを観察しました。 Kumar et al. (2020) はまた、CK (6-ベンジルアデニン) で処理し熱ストレスにさらしたヒヨコマメ植物がFv/Fm比を増加させることを発見し、ゼアキサンチン色素サイクルを活性化することによりCKの葉面散布がPSII活性を促進すると結論付けました。 さらに、BR葉面散布は複合ストレス条件下でPSII光合成を促進し、この植物ホルモンの施用によりPSIIアンテナの励起エネルギーの散逸が減少し、葉緑体における小さな熱ショックタンパク質の蓄積が促進されることを示しました (Ogweno et al. 2008; Kothari and Lachowitz , 2021)。
MDA およびプロリン含有量は、最適条件下で生育した植物と比較して、植物が非生物的ストレス下にある場合に増加することが多い (Alvarado-Sanabria et al. 2017)。以前の研究でも、MDA およびプロリン レベルは、日中または夜間の高温下でのイネにおける適応プロセスまたは農業慣行の影響を理解するために使用できる生化学的指標であることが示されています (Alvarado-Sanabria et al., 2017; Quintero-Calderón et al. . , 2021)。これらの研究では、MDA およびプロリン含有量は、それぞれ夜間または日中に高温にさらされたイネで高くなる傾向があることも示されています。ただし、CK および BR の葉面散布は、主に耐性遺伝子型において、MDA の減少とプロリン レベルの増加に寄与しました (Federroz 67)。 CKスプレーはサイトカイニンオキシダーゼ／デヒドロゲナーゼの過剰発現を促進し、ベタインやプロリンなどの保護化合物の含有量を増加させます（Liu et al., 2020）。BRはベタイン、糖、アミノ酸（遊離プロリンを含む）などの浸透圧保護物質の誘導を促進し、多くの悪環境下において細胞内の浸透圧バランスを維持します（Kothari and Lachowiec, 2021）。
作物ストレス指数（CSI）と相対耐性指数（RTI）は、評価対象の処理がさまざまなストレス（非生物的および生物的）を緩和するのに役立ち、植物生理にプラスの効果をもたらすかどうかを判断するために使用されます（Castro-Duque et al., 2020; Chavez-Arias et al., 2020）。CSI値は0～1の範囲で、それぞれ非ストレスおよびストレス状態を表します（Lee et al., 2010）。熱ストレス（SC）を受けた植物のCSI値は0.8～0.9の範囲でした（図2B）。これは、イネが複合ストレスによって悪影響を受けたことを示しています。ただし、BC（0.6）またはCK（0.6）の葉面散布は、SCイネと比較して、主に非生物的ストレス条件下でこの指標の減少をもたらしました。 F2000植物では、RTIはSA（33.52％）と比較してCA（97.69％）およびBC（60.73％）を使用した場合に高い増加を示しており、これらの植物成長調整剤がイネの組成物の耐性への反応の改善にも寄与していることを示しています。過熱。これらの指標は、さまざまな種のストレス状態を管理するために提案されています。Leeら（2010）が実施した研究では、中程度の水ストレス下における2種類の綿花品種のCSIは約0.85であったのに対し、十分に灌漑された品種のCSI値は0.4～0.6の範囲であり、この指標は品種の水適応の指標であると結論付けています。ストレスの多い条件。さらに、Chavez-Ariasら（2020）は、C. elegans植物における包括的なストレス管理戦略としての合成エリシターの有効性を評価し、これらの化合物を散布した植物はより高いRTI（65％）を示すことを発見しました。上記に基づき、CK と BR は、植物成長調整剤であり、肯定的な生化学的および生理学的反応を誘発するため、複雑な熱ストレスに対するイネの耐性を高めることを目的とした農業戦略として考えることができます。
過去数年間、コロンビアのイネ研究では、生理学的または生化学的特性を用いて、昼間または夜間の高温に耐性のある遺伝子型を評価することに重点を置いてきました (Sánchez-Reinoso et al., 2014; Alvarado-Sanabria et al., 2021)。しかし、ここ数年、国内の複雑な熱ストレス期間の影響を改善するための総合的な作物管理を提案するために、実用的、経済的、かつ収益性の高い技術の分析がますます重要になっています (Calderón-Páez et al., 2021; Quintero-Calderon et al., 2021) 。したがって、本研究で観察された複雑な熱ストレス (日中 40°C/夜間 30°C) に対するイネの生理学的および生化学的反応は、CK または BR による葉面散布が悪影響を緩和するための適切な作物管理方法である可能性を示唆しています。中程度の熱ストレス期間の影響。これらの処理により、両イネ遺伝子型の耐性（低CSIおよび高RTI）が向上し、複合熱ストレス下における植物の生理学的および生化学的反応における一般的な傾向が示されました。イネの主な反応は、GC、総クロロフィル、クロロフィルαおよびβ、そしてカロテノイド含量の減少でした。さらに、植物はPSII損傷（Fv/Fm比などのクロロフィル蛍光パラメータの低下）と脂質過酸化の増加を経験しました。一方、イネをCKおよびBRで処理した場合、これらの悪影響は軽減され、プロリン含量が増加しました（図4）。
図4. 熱ストレスと植物成長調整剤の葉面散布がイネに及ぼす複合影響の概念モデル。赤矢印と青矢印は、熱ストレスとBR（ブラシノステロイド）およびCK（サイトカイニン）の葉面散布との相互作用が、それぞれ生理学的および生化学的反応に及ぼす負の影響と正の影響を示している。gs：気孔コンダクタンス、Total Chl：総クロロフィル含量、Chl α：クロロフィルβ含量、Cx+c：カロテノイド含量。
要約すると、本研究における生理学的および生化学的反応は、Fedearroz 2000 イネが Fedearroz 67 イネよりも複合的な熱ストレスの期間に対して感受性が高いことを示している。本研究で評価したすべての成長調整剤（オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、またはブラシノステロイド）は、ある程度の複合的な熱ストレス軽減を示した。しかし、サイトカイニンとブラシノステロイドは、両方の植物成長調整剤が、何も施用していないイネと比較してクロロフィル含有量、α-クロロフィル蛍光パラメータ、gs および RWC を増加させ、MDA 含有量とキャノピー温度を低下させたため、より優れた植物適応を誘導した。要約すると、植物成長調整剤（サイトカイニンおよびブラシノステロイド）の使用は、高温期の厳しい熱ストレスによって引き起こされるイネ作物のストレス状態を管理する上で有用なツールであると結論付けられる。
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投稿日時: 2024年8月8日