コロンビアでは、気候変動と気候変動の影響で米の生産量が減少している。植物成長調節剤は、さまざまな作物の熱ストレスを軽減するための戦略として使用されてきました。したがって、この研究の目的は、複合熱ストレス（日中と夜間の高温）、キャノピー温度、相対水分含有量にさらされた 2 つの市販イネ遺伝子型の生理学的効果（気孔コンダクタンス、気孔コンダクタンス、総クロロフィル含有量、Fv/Fm 比）と生化学的変数（マロンジアルデヒド（MDA）とプロリン酸含有量）を評価することでした。最初の実験と 2 番目の実験は、それぞれ Federrose 67（「F67」）と Federrose 2000（「F2000」）の 2 つのイネ遺伝子型の植物を使用して実施されました。両方の実験は、一連の実験として一緒に分析されました。設定された処理は次のとおりです。絶対コントロール（AC）（最適な温度（日中/夜間温度 30/25°C）で栽培されたイネ）、熱ストレスコントロール（SC）[複合熱ストレスのみにさらされたイネ（40/25°C）。 30°C)]、イネ植物にストレスを与え、植物成長調節剤（ストレス+AUX、ストレス+BR、ストレス+CKまたはストレス+GA）を2回（熱ストレスの5日前と5日後）散布した。SAを散布すると、SC植物（「F67」植物の生重量は2.36および2.56 mg）と比較して、両品種（イネ植物「F67」と「F2000」の生重量はそれぞれ3.25および3.65 mg/g）の総クロロフィル含有量が増加した。g-1）」およびイネ「F2000」では、CKの葉面散布も、熱ストレス対照と比較して、イネ「F2000」植物の気孔コンダクタンスを一般的に改善した（499.25 vs. 150.60 mmol m-2 s）。熱ストレスでは、植物冠の温度が2～3 °C低下し、植物のMDA含有量が減少する。相対耐性指数は、CK（97.69%）とBR（60.73%）の葉面散布が、主にF2000イネにおける複合高温ストレスの問題を軽減するのに役立つことを示している。結論として、BRまたはCKの葉面散布は、複合高温ストレス条件がイネの生理的挙動に及ぼす悪影響を軽減するのに役立つ農業戦略として考慮できる。
イネ（Oryza sativa）はイネ科に属し、トウモロコシや小麦と並んで世界で最も栽培されている穀物の1つです（Bajaj and Mohanty、2005）。イネの栽培面積は617,934ヘクタールで、2020年の国内生産量は2,937,840トン、平均収量は5.02トン/ヘクタールでした（Federarroz（Federación Nacional de Arroceros）、2021）。
地球温暖化は稲作に影響を与え、高温や干ばつなどのさまざまな非生物的ストレスを引き起こしています。気候変動により地球の気温が上昇しており、21世紀には気温が1.0～3.7℃上昇すると予測されています。これにより、熱ストレスの頻度と強度が増加する可能性があります。環境温度の上昇は稲作に影響を与え、収穫量が6～7%減少しています。一方、気候変動は、熱帯および亜熱帯地域における深刻な干ばつや高温などの作物にとって好ましくない環境条件も引き起こします。さらに、エルニーニョなどの変動現象は、熱ストレスを引き起こし、一部の熱帯地域で作物の被害を悪化させる可能性があります。コロンビアでは、稲作地域の気温が2050年までに2～2.5℃上昇すると予測されており、米の生産量が減少するとともに、市場やサプライチェーンへの製品の流れに影響が出ています。
ほとんどの稲作は、作物の生育に最適な範囲に近い気温の地域で行われている（Shah et al., 2011）。稲の生育と発達一般的に、それぞれ 28 °C と 22 °C です (Kilasi et al., 2018; Calderón-Páez et al., 2021)。これらの閾値を超える温度は、イネの発育の敏感な段階 (分げつ、開花、開花、登熟) に中程度から重度の熱ストレスを引き起こし、穀物収量に悪影響を及ぼします。この収量減少は主に、植物の生理機能に影響を与える長期間の熱ストレスによるものです。ストレスの持続時間や到達した最高温度などのさまざまな要因の相互作用により、熱ストレスは植物の代謝と発達にさまざまな不可逆的な損傷を引き起こす可能性があります。
熱ストレスは植物のさまざまな生理学的および生化学的プロセスに影響を与えます。葉の光合成はイネ植物において熱ストレスに最も影響を受けやすいプロセスの 1 つです。日中の気温が 35 °C を超えると光合成速度が 50% 低下します。イネ植物の生理的反応は熱ストレスの種類によって異なります。たとえば、植物が日中の高温 (33〜40 °C) または日中と夜間の両方の高温 (日中 35〜40 °C、夜間 28〜30 °C) にさらされると、光合成速度と気孔コンダクタンスが阻害されます (Lü et al., 2013; Fahad et al., 2016; Chaturvedi et al., 2017)。夜間の高温 (30 °C) は光合成を中程度に阻害しますが、夜間の呼吸を増加させます (Fahad et al., 2016; Alvarado-Sanabria et al., 2017)。ストレス期間に関わらず、熱ストレスはイネの葉のクロロフィル含有量、クロロフィル可変蛍光と最大クロロフィル蛍光の比（Fv/Fm）、およびRubisco活性化にも影響を与える（Cao et al. 2009; Yin et al. 2010）。Sanchez Reynoso et al., 2014）。
生化学的変化は、熱ストレスに対する植物の適応のもう 1 つの側面です (Wahid et al., 2007)。プロリン含有量は、植物ストレスの生化学的指標として使用されてきました (Ahmed and Hassan 2011)。プロリンは、高温条件下で炭素源または窒素源として、また膜安定剤として作用するため、植物代謝において重要な役割を果たします (Sánchez-Reinoso et al., 2014)。高温はまた、脂質過酸化を介して膜の安定性に影響を与え、マロンジアルデヒド (MDA) の生成につながります (Wahid et al., 2007)。したがって、MDA 含有量は、熱ストレス下での細胞膜の構造的完全性を理解するためにも使用されてきました (Cao et al., 2009 ; Chavez-Arias et al., 2018 )。最後に、複合的な熱ストレス[37/30℃（昼/夜）]は、イネの電解質漏出率とマロンジアルデヒド含有量を増加させた（Liu et al., 2013）。
植物成長調節物質（GR）の使用は、熱ストレスの悪影響を軽減するために評価されてきた。これらの物質は、熱ストレスに対する植物の反応や生理的防御機構に積極的に関与しているからである（Peleg and Blumwald, 2011; Yin et al., 2011; Ahmed et al., 2015）。遺伝資源の外因的適用は、さまざまな作物の熱ストレス耐性にプラスの効果をもたらしてきた。研究によると、ジベレリン（GA）、サイトカイニン（CK）、オーキシン（AUX）、ブラシノステロイド（BR）などの植物ホルモンは、さまざまな生理学的および生化学的変数の増加につながることが示されている（Peleg and Blumwald, 2011; Yin et al. Ren, 2011; Mitler et al., 2012; Zhou et al., 2014）。コロンビアでは、遺伝資源の外因的適用とそれがイネ作物に与える影響は十分に理解されておらず、研究もされていません。しかし、以前の研究では、BRの葉面散布は、イネ苗の葉のガス交換特性、クロロフィルまたはプロリン含有量を改善することにより、イネの耐性を向上させる可能性があることが示されています（Quintero-Calderón et al., 2021）。
サイトカイニンは、熱ストレスを含む非生物的ストレスに対する植物の応答を媒介します（Ha et al., 2012）。さらに、CKの外因性施用は熱による損傷を軽減できることが報告されています。例えば、ゼアチンの外因性施用は、熱ストレス中のクリーピングベントグラス（Agrotis estolonifera）の光合成速度、クロロフィルaおよびb含有量、電子伝達効率を増加させました（Xu and Huang, 2009; Jespersen and Huang, 2015）。ゼアチンの外因性施用は、抗酸化活性を向上させ、様々なタンパク質の合成を促進し、植物組織における活性酸素種（ROS）による損傷およびマロンジアルデヒド（MDA）の生成を減少させることもできます（Chernyadyev, 2009; Yang et al., 2009）。、2016; Kumar et al., 2020）。
ジベレリン酸の使用は、熱ストレスに対しても肯定的な反応を示しています。研究によると、GA生合成はさまざまな代謝経路を媒介し、高温条件下での耐性を高めます（Alonso-Ramirez et al. 2009; Khan et al. 2020）。Abdel-Nabi et al. (2020) は、外因性GA（25または50 mg*L）の葉面散布により、対照植物と比較して、熱ストレスを受けたオレンジ植物の光合成速度と抗酸化活性が増加することを見出しました。また、外因性HAの適用により、熱ストレス下のナツメヤシ（Phoenix dactylifera）の相対水分含有量、クロロフィルおよびカロテノイド含有量が増加し、脂質過酸化が減少することも観察されています（Khan et al., 2020）。オーキシンは高温条件に対する適応的成長反応の調節にも重要な役割を果たしている（Sun et al., 2012; Wang et al., 2016）。この成長調節物質は、非生物的ストレス下でのプロリン合成や分解などのさまざまなプロセスにおいて生化学的マーカーとして作用する（Ali et al., 2007）。さらに、AUXは抗酸化活性も高め、脂質過酸化の減少により植物中のMDAの減少につながる（Bielach et al., 2017）。Sergeev et al.（2018）は、熱ストレス下のエンドウ（Pisum sativum）において、プロリン-ジメチルアミノエトキシカルボニルメチル）ナフチルクロロメチルエーテル（TA-14）の含有量が増加することを観察した。同じ実験で、AUXで処理した植物では、処理していない植物と比較してMDAレベルが低いことも観察された。
ブラシノステロイドは、熱ストレスの影響を軽減するために使用される別の種類の成長調節物質です。Ogweno ら (2008) は、熱ストレス下にあるトマト (Solanum lycopersicum) 植物に外因性 BR を散布すると、8 日間の熱ストレス下で、正味光合成速度、気孔コンダクタンス、および Rubisco カルボキシル化の最大速度が増加すると報告しました。エピブラシノステロイドの葉面散布は、熱ストレス下にあるキュウリ (Cucumis sativus) 植物の正味光合成速度を増加させることができます (Yu ら、2004)。さらに、外因性 BR の適用は、熱ストレス下にある植物のクロロフィル分解を遅らせ、PSII 光化学の水分利用効率と最大量子収率を増加させます (Holá ら、2010; Toussagunpanit ら、2015)。
気候変動と変動により、米作物は日中の気温が高い期間に直面します（Lesk et al., 2016; Garcés, 2020; Federarroz (Federación Nacional de Arroceros), 2021）。植物の表現型解析では、稲作地域の熱ストレスを緩和する戦略として植物栄養素または生物刺激剤の使用が研究されています (Alvarado-Sanabria et al., 2017; Calderón-Páez et al., 2021; Quintero-Calderón et al., 2021)。さらに、生化学的および生理学的変数（葉温、気孔コンダクタンス、クロロフィル蛍光パラメータ、クロロフィルおよび相対水分含有量、マロンジアルデヒドおよびプロリン合成）の使用は、国内外で熱ストレス下にあるイネ植物をスクリーニングするための信頼できるツールです（Sánchez -Reynoso et al., 2014; Alvarado-Sanabria et al., 2017; ただし、イネにおける葉面散布植物ホルモンスプレーの使用に関する研究は、地域レベルでは依然としてまれです。したがって、植物成長調節剤の適用による生理学的および生化学的反応の研究は、イネにおける複合熱ストレス期間の悪影響に対処するための実践的な農業戦略を提案する上で非常に重要です。したがって、本研究の目的は、4つの植物成長調節剤（AUX、CK、GAおよびBR）の葉面散布による生理学的（気孔コンダクタンス、クロロフィル蛍光パラメータおよび相対水分含有量）および生化学的効果を評価することでした。 （光合成色素、マロンジアルデヒド、プロリン含有量）複合的な高温ストレス（昼夜ともに高温）にさらされた2つの市販イネ品種における変数。
この研究では、2 つの独立した実験が行われました。フェダーローズ 67 (F67: 過去 10 年間の高温下で開発された遺伝子型) とフェダーローズ 2000 (F2000: 20 世紀末の 10 年間に開発され、白葉ウイルスに対する耐性を示す遺伝子型) の遺伝子型が、それぞれ最初の実験と 2 番目の実験で使用されました。両方の遺伝子型は、コロンビアの農家によって広く栽培されています。種子は、有機物 2% を含む砂壌土が入った 10 L トレイ (長さ 39.6 cm、幅 28.8 cm、高さ 16.8 cm) に播種されました。各トレイに、事前に発芽させた種子を 5 つ植えました。パレットは、コロンビア国立大学農学部ボゴタキャンパス（北緯43°50′56″、西経74°04′051″）の温室（海抜2556m）に設置され、2019年10月から12月にかけて実施されました。2020年の同じシーズンに、1つの実験（Federroz 67）と2つ目の実験（Federroz 2000）が行われました。
各栽培期間中の温室内の環境条件は以下のとおりです。昼夜温度 30/25℃、相対湿度 60～80%、自然光周期 12 時間 (正午の光合成有効放射 1500 µmol (光子) m-2 s-)。植物は、Sánchez-Reinoso ら (2019) に従って、種子発芽後 20 日 (DAE) に各元素の含有量に応じて施肥されました。窒素 670 mg/株、リン 110 mg/株、カリウム 350 mg/株、カルシウム 68 mg/株、マグネシウム 20 mg/株、硫黄 20 mg/株、ケイ素 17 mg/株。植物には、ホウ素 10 mg/株、銅 17 mg/株、亜鉛 44 mg/株が含まれています。各実験において、イネは、この期間中に生育段階 V5 に達した時点で、47 DAE まで維持されました。これまでの研究では、この生育段階はイネの熱ストレス研究を行うのに適切な時期であることが示されている（Sánchez-Reinoso et al., 2014; Alvarado-Sanabria et al., 2017）。
各実験では、葉成長調節剤を2回別々に散布した。最初の葉面植物ホルモン散布は、植物を環境ストレスに備えさせるため、熱ストレス処理の5日前（42 DAE）に実施した。2回目の葉面散布は、植物がストレス条件下に置かれた5日後（52 DAE）に実施した。4種類の植物ホルモンを使用し、本研究で散布した各有効成分の特性は補足表1に記載されている。使用した葉成長調節剤の濃度は以下のとおりである。（i）オーキシン（1-ナフチル酢酸：NAA）濃度5 × 10−5 M、（ii）ジベレリン（ジベレリン酸：NAA）濃度5 × 10–5 M、GA3。 (iii) サイトカイニン (トランス-ゼアチン) 1 × 10⁻⁵ M (iv) ブラシノステロイド [スピロスタン-6-オン、3,5-ジヒドロキシ-、(3b,5a,25R)] 5 × 10⁻⁵ M。これらの濃度は、正の反応を誘発し、熱ストレスに対する植物の抵抗性を高めるため選択された (Zahir et al., 2001; Wen et al., 2010; El-Bassiony et al., 2012; Salehifar et al., 2017)。植物成長調節剤を散布していないイネには、蒸留水のみを散布した。すべてのイネには、手動噴霧器で散布した。葉の表裏を湿らせるために、植物に 20 ml の H₂O を散布する。すべての葉面散布には、農業補助剤 (Agrotin、Bayer CropScience、コロンビア) を 0.1% (v/v) 使用した。鉢と噴霧器の間の距離は30cmです。
各実験において、最初の葉面散布から5日後（播種後47日目）に熱ストレス処理を実施した。イネを温室から294 Lの生育チャンバー（MLR-351H、Sanyo、イリノイ州、米国）に移し、熱ストレスを与えるか、または同じ環境条件を維持した（播種後47日目）。複合熱ストレス処理は、チャンバーを以下の昼夜温度に設定して実施した。日中の高温[40℃で5時間（11:00から16:00まで）]と夜間[30℃で5時間]。8日間連続（19:00から24:00まで）。ストレス温度と曝露時間は、以前の研究（Sánchez-Reynoso et al. 2014; Alvarado-Sanabría et al. 2017）に基づいて選択した。一方、生育室に移された植物群は、8日間連続で同じ温度（日中は30℃、夜間は25℃）の温室内に置かれた。
実験終了時に、以下の処理群が得られました: (i) 生育温度条件 + 蒸留水の施用 [絶対対照 (AC)]、(ii) 熱ストレス条件 + 蒸留水の施用 [熱ストレス対照 (SC)]、(iii) 熱ストレス条件 + オーキシン施用 (AUX)、(iv) 熱ストレス条件 + ジベレリン施用 (GA)、(v) 熱ストレス条件 + サイトカイニン施用 (CK)、および (vi) 熱ストレス条件 + ブラシノステロイド (BR) 付録。これらの処理群は、2 つの遺伝子型 (F67 および F2000) に使用されました。すべての処理は、1 つの植物からなる 5 つの反復による完全無作為化デザインで実施されました。各植物は、実験終了時に決定された変数を読み取るために使用されました。実験は 55 DAE まで続きました。
気孔コンダクタンス（gs）は、0～1000 mmol m-2 s-1の範囲で測定可能な携帯型ポロソメーター（SC-1、METER Group Inc.、米国）を用いて測定した。サンプルチャンバーの開口部は6.35 mmである。測定は、植物の主茎が完全に展開した成熟葉に気孔計プローブを取り付けて行った。各処理について、11:00～16:00の間に各植物の3枚の葉でgsの測定値を取得し、平均値を算出した。
RWCは、Ghoulamら（2002）が記述した方法に従って測定した。gの測定に使用した完全に展開したシートは、RWCの測定にも使用した。生重量（FW）は、収穫直後にデジタルスケールを使用して測定した。次に、葉を水を入れたプラスチック容器に入れ、室温（22℃）で48時間暗所に置いた。その後、デジタルスケールで重量を測定し、展開重量（TW）を記録した。膨張した葉を75℃で48時間オーブン乾燥させ、乾燥重量（DW）を記録した。
相対クロロフィル含有量はクロロフィルメーター（atLeafmeter、FT Green LLC、米国）を使用して測定し、atLeaf単位で表した（Dey et al.、2016）。PSIIの最大量子効率の測定値（Fv/Fm比）は、連続励起クロロフィル蛍光計（Handy PEA、Hansatech Instruments、英国）を使用して記録した。Fv/Fm測定の前に、葉クランプを使用して葉を20分間暗順応させた（Restrepo-DiazおよびGarces-Varon、2013）。葉が暗順応した後、ベースライン（F0）と最大蛍光（Fm）を測定した。これらのデータから、可変蛍光（Fv = Fm – F0）、可変蛍光と最大蛍光の比（Fv/Fm）、PSII光化学反応の最大量子収率（Fv/F0）、および比Fm/F0が計算された（Baker、2008; Lee et al.、2017）。相対クロロフィルとクロロフィル蛍光の測定値は、gs測定に使用したのと同じ葉で取得された。
生化学的変数として、約 800 mg の葉の生重量を採取した。葉のサンプルは液体窒素中で均質化され、さらなる分析のために保存された。組織のクロロフィル a、b およびカロテノイド含有量を推定するために使用された分光法は、Wellburn (1994) によって記述された方法と方程式に基づいている。葉組織サンプル (30 mg) を採取し、3 ml の 80% アセトンで均質化した。サンプルは、粒子を除去するために、5000 rpm (モデル 420101、Becton Dickinson Primary Care Diagnostics、米国) で 10 分間遠心分離した。上清は、80% アセトン (Sims and Gamon、2002) を加えて最終容量 6 ml に希釈した。クロロフィル含有量は663 nm（クロロフィルa）と646 nm（クロロフィルb）で、カロテノイド含有量は470 nmで分光光度計（Spectronic BioMate 3 UV-vis、Thermo、米国）を用いて測定した。
Hodgesら（1999）が記載したチオバルビツール酸（TBA）法を用いて、膜脂質過酸化（MDA）を評価した。また、約0.3gの葉組織を液体窒素中でホモジナイズした。サンプルを5000rpmで遠心分離し、分光光度計を用いて440、532、600nmの吸光度を測定した。最後に、消光係数（157 M mL−1）を用いてMDA濃度を算出した。
すべての処理のプロリン含有量は、Bates ら (1973) が記載した方法を使用して測定した。保存したサンプルに 3% スルホサリチル酸水溶液 10 ml を加え、ワットマンろ紙 (No. 2) でろ過する。次に、このろ液 2 ml を無水酸 2 ml および氷酢酸 2 ml と反応させる。混合物を 90 ℃ のウォーターバスに 1 時間置いた。氷上でインキュベートすることにより反応を停止する。ボルテックスシェーカーを使用してチューブを激しく振とうし、得られた溶液をトルエン 4 ml に溶解する。吸光度は、光合成色素の定量に使用したのと同じ分光光度計 (Spectronic BioMate 3 UV-Vis、Thermo、Madison、WI、USA) を使用して 520 nm で測定した。
キャノピー温度と CSI を計算するために Gerhards ら (2016) が説明した方法。ストレス期間の終わりに ±2°C の精度で FLIR 2 カメラ (FLIR Systems Inc.、ボストン、マサチューセッツ州、米国) を使用して熱写真を撮影した。撮影のために植物の後ろに白い面を配置した。ここでも、2 つの工場が参照モデルとして考慮された。植物は白い面に置かれ、一方はすべての気孔の開口をシミュレートするために農業補助剤 (Agrotin、Bayer CropScience、ボゴタ、コロンビア) でコーティングされ [湿潤モード (Twet)]、もう一方は何も適用されていない葉 [乾燥モード (Tdry)] であった (Castro -Duque ら、2020)。撮影中のカメラと鉢の間の距離は 1 m であった。
相対耐性指数は、本研究で評価した処理済み遺伝子型の耐性を決定するために、処理済み植物の気孔コンダクタンス（gs）を対照植物（ストレス処理を行っておらず、成長調節剤を適用した植物）と比較して間接的に計算した。RTIは、Chávez-Ariasら（2020）の式を改変して得た。
各実験において、上記に挙げたすべての生理学的変数は、播種後55日目に、上層部から採取した完全に展開した葉を用いて測定・記録した。さらに、植物の生育環境を変化させないように、測定は生育チャンバー内で実施した。
最初の実験と 2 番目の実験のデータは、一連の実験としてまとめて分析されました。各実験グループは 5 つの植物で構成され、各植物が実験単位を構成しました。分散分析 (ANOVA) が実行されました (P ≤ 0.05)。有意差が検出された場合は、P ≤ 0.05 で Tukey の事後比較検定が使用されました。パーセント値の変換には、アークサイン関数を使用します。データは Statistix v 9.0 ソフトウェア (Analytical Software、タラハシー、フロリダ州、米国) を使用して分析され、SigmaPlot (バージョン 10.0、Systat Software、サンノゼ、カリフォルニア州、米国) を使用してプロットされました。主成分分析は、InfoStat 2016 ソフトウェア (Analysis Software、コルドバ国立大学、アルゼンチン) を使用して実行され、研究対象の最適な植物成長調節剤が特定されました。
表 1 は、実験、異なる処理、およびそれらの葉の光合成色素 (クロロフィル a、b、総量、およびカロテノイド)、マロンジアルデヒド (MDA) およびプロリン含有量、気孔コンダクタンスとの相互作用を示す ANOVA をまとめたものです。gs、相対水分含有量 (RWC)、クロロフィル含有量、クロロフィル アルファ蛍光パラメータ、冠部温度 (PCT) (°C)、作物ストレス指数 (CSI)、および 55 DAE のイネ植物の相対耐性指数の影響。
表1. 実験（遺伝子型）と熱ストレス処理間のイネの生理学的および生化学的変数に関するANOVAデータの要約。
表 2 には、実験と処理間の葉の光合成色素相互作用、相対クロロフィル含有量 (Atleaf の読み取り値)、およびアルファクロロフィル蛍光パラメーターの差 (P≤0.01) が示されています。日中と夜間の高温により、総クロロフィルとカロテノイド含有量が増加しました。最適な温度条件下で栽培された植物 (2.67 mg g -1) と比較して、植物ホルモンの葉面散布を行わなかったイネ実生 (「F67」では 2.36 mg g-1、「F2000」では 2.56 mg g-1) は、総クロロフィル含有量が低くなりました。両方の実験で、「F67」は 2.80 mg g-1、「F2000」は 2.80 mg g-1 でした。さらに、熱ストレス下でAUXとGAの混合スプレー処理を行ったイネ苗では、熱ストレス条件下で両遺伝子型（「F67」の場合、AUX = 1.96 mg g-1、GA = 1.45 mg g-1、および「F67」の場合、AUX = 1.96 mg g-1、GA = 1.45 mg g-1、および「F2000」の場合、AUX = 2.24 mg g-1、GA = 1.43 mg g-1）でクロロフィル含有量の減少が認められた。熱ストレス条件下では、BRの葉面散布により両遺伝子型でこの変数がわずかに増加した。最後に、CK葉面散布は、F67（3.24 mg g-1）およびF2000（3.65 mg g-1）遺伝子型において、すべての処理（AUX、GA、BR、SC、AC処理）の中で最も高い光合成色素値を示した。クロロフィルの相対含有量（A葉単位）も複合的な熱ストレスによって減少した。両方の遺伝子型において、CCを散布した植物でも最高値が記録された（「F67」では41.66、「F2000」では49.30）。FvおよびFv/Fm比は、処理と品種間で有意差を示した（表2）。全体として、これらの変数の中で、F67品種はF2000品種よりも熱ストレスに対する感受性が低かった。FvおよびFv/Fm比は、2回目の実験でより大きな影響を受けた。ストレスを受けた「F2000」実生は、植物ホルモンを散布しなかったため、Fv 値 (2120.15) と Fv/Fm 比 (0.59) が最も低かったが、CK を葉面散布するとこれらの値が回復した (Fv: 2591.89、Fv/Fm 比: 0.73)。最適な温度条件下で栽培された「F2000」植物で記録された値と同様の値 (Fv: 2955.35、Fv/Fm 比: 0.73:0.72) が得られた。初期蛍光 (F0)、最大蛍光 (Fm)、PSII の最大光化学量子収率 (Fv/F0)、および Fm/F0 比に有意差はなかった。最後に、BR は CK と同様の傾向を示した (Fv 2545.06、Fv/Fm 比 0.73)。
表2. 複合熱ストレス（昼夜40°/30°C）が、2つのイネ遺伝子型[Federrose 67（F67）およびFederrose 2000（F2000）]の植物における、出芽後55日目（DAE）の葉の光合成色素[総クロロフィル（Chl Total）、クロロフィルa（Chl a）、クロロフィルb（Chl b）およびカロテノイドCx+c]、相対クロロフィル含有量（アトリフ単位）、クロロフィル蛍光パラメータ（初期蛍光（F0）、最大蛍光（Fm）、可変蛍光（Fv）、最大PSII効率（Fv/Fm）、PSIIの光化学的最大量子収率（Fv/F0）およびFm/F0）に及ぼす影響。
異なる処理を施したイネ植物の相対水分含有量（RWC）は、実験処理と葉面散布処理の相互作用において有意差（P ≤ 0.05）を示した（図1A）。SA処理では、両遺伝子型で最低値が記録された（F67で74.01%、F2000で76.6%）。熱ストレス条件下では、異なる植物ホルモンで処理した両遺伝子型のイネ植物のRWCは有意に増加した。全体として、CK、GA、AUX、またはBRの葉面散布により、RWCは実験中に最適な条件下で生育した植物の値と同程度に増加した。絶対対照および葉面散布植物は、両遺伝子型で約83%の値を示した。一方、gsも実験処理の相互作用において有意差（P ≤ 0.01）を示した（図1B）。絶対対照（AC）植物も各遺伝子型で最も高い値を示した（F67では440.65 mmol m-2s-1、F2000では511.02 mmol m-2s-1）。複合熱ストレスのみを受けたイネ植物は、両遺伝子型で最も低いgs値を示した（F67では150.60 mmol m-2s-1、F2000では171.32 mmol m-2s-1）。すべての植物成長調節剤による葉面処理もgを増加させた。CCを散布したF2000イネ植物では、植物ホルモンの葉面散布の効果はより顕著であった。この植物群は絶対対照植物と比較して差を示さなかった（AC 511.02、CC 499.25 mmol m-2s-1）。
図 1. 発芽後 55 日 (DAE) の 2 つのイネ遺伝子型 (F67 および F2000) の植物における、複合熱ストレス (昼/夜 40°/30°C) が相対含水量 (RWC) (A)、気孔コンダクタンス (gs) (B)、マロンジアルデヒド (MDA) 生成 (C)、およびプロリン含量 (D) に及ぼす影響。各遺伝子型について評価した処理は、絶対対照 (AC)、熱ストレス対照 (SC)、熱ストレス + オーキシン (AUX)、熱ストレス + ジベレリン (GA)、熱ストレス + 細胞分裂促進因子 (CK)、および熱ストレス + ブラシノステロイド (BR) であった。各列は、5 つのデータポイント (n = 5) の平均 ± 標準誤差を表す。列の後に異なる文字が付いている場合は、Tukey 検定 (P ≤ 0.05) に従って統計的に有意な差があることを示す。等号が付いている場合は、平均値が統計的に有意ではない (≤ 0.05) ことを示す。
MDA (P ≤ 0.01) およびプロリン (P ≤ 0.01) 含有量も、実験と植物ホルモン処理の相互作用において有意差を示した (図 1C、D)。 SC 処理では両方の遺伝子型で脂質過酸化の増加が観察された (図 1C) が、葉成長調節剤スプレーで処理した植物では両方の遺伝子型で脂質過酸化が減少した。 一般的に、植物ホルモン (CA、AUC、BR または GA) の使用は、脂質過酸化 (MDA 含有量) の減少につながる。 2 つの遺伝子型の AC 植物と、熱ストレス下で植物ホルモンを散布した植物の間には違いは見られなかった (「F67」植物の FW 値は 4.38 ～ 6.77 µmol g-1 の範囲であり、「F2000」植物の FW 値は 2.84 ～ 9.18 µmol g-1 (植物) の範囲であった)。一方、「F67」植物のプロリン合成は、複合ストレス下では「F2000」植物よりも低く、プロリン生産の増加につながった。熱ストレスを受けたイネ植物では、両方の実験で、これらのホルモンの投与により F2000 植物のアミノ酸含有量が有意に増加することが観察された (AUX と BR はそれぞれ 30.44 µmol g-1 と 18.34 µmol g-1) (図 1G)。
葉面散布による植物成長調節剤の散布と複合的な熱ストレスが植物のキャノピー温度と相対耐性指数（RTI）に及ぼす影響を図2AとBに示します。両方の遺伝子型において、AC植物のキャノピー温度は27℃近く、SC植物のキャノピー温度は28℃前後でした。また、CKとBRによる葉面処理により、SC植物と比較してキャノピー温度が2～3℃低下したことも観察されました（図2A）。RTIは他の生理学的変数と同様の挙動を示し、実験と処理の相互作用において有意差（P ≤ 0.01）を示しました（図2B）。SC植物は両方の遺伝子型において植物耐性が低く（「F67」と「F2000」イネ植物でそれぞれ34.18%と33.52%）、高温ストレスにさらされた植物では植物ホルモンの葉面施肥によりRTIが向上します。この効果は、RTIが97.69であったCCを散布した「F2000」植物でより顕著であった。一方、葉面散布ストレス条件下におけるイネ植物の収量ストレス指数（CSI）にのみ有意差が認められた（P ≤ 0.01）（図2B）。複合熱ストレスを受けたイネ植物のみが最高のストレス指数値（0.816）を示した。イネ植物に様々な植物ホルモンを散布すると、ストレス指数は低くなった（0.6～0.67の値）。最後に、最適な条件下で栽培されたイネ植物の値は0.138であった。
図 2. 複合熱ストレス (昼/夜 40°/30°C) が 2 つの植物種のキャノピー温度 (A)、相対耐性指数 (RTI) (B)、および作物ストレス指数 (CSI) (C) に及ぼす影響。市販のイネ遺伝子型 (F67 および F2000) にさまざまな熱処理を施した。各遺伝子型について評価した処理には、絶対コントロール (AC)、熱ストレスコントロール (SC)、熱ストレス + オーキシン (AUX)、熱ストレス + ジベレリン (GA)、熱ストレス + 細胞分裂促進因子 (CK)、および熱ストレス + ブラシノステロイド (BR) が含まれる。複合熱ストレスとは、イネを高い昼/夜温度 (昼/夜 40°/30°C) にさらすことである。各列は、5 つのデータポイント (n = 5) の平均 ± 標準誤差を表す。列の後に異なる文字が付いている場合は、Tukey 検定 (P ≤ 0.05) に従って統計的に有意な差があることを示す。等号が付いている文字は、平均値が統計的に有意ではない（≤ 0.05）ことを示します。
主成分分析（PCA）により、55 DAEで評価された変数が、成長調節剤スプレーで処理された熱ストレスを受けたイネ植物の生理的および生化学的応答の66.1%を説明することが明らかになった（図3）。ベクトルは変数を表し、点は植物成長調節剤（GR）を表す。gs、クロロフィル含有量、PSIIの最大量子効率（Fv/Fm）、および生化学的パラメーター（TChl、MDA、プロリン）のベクトルは原点に近い角度にあり、植物の生理的挙動と変数との間に高い相関があることを示している。1つのグループ（V）には、最適温度（AT）で生育したイネ苗と、CKおよびBAで処理されたF2000植物が含まれていた。同時に、GRで処理された植物の大部分は別のグループ（IV）を形成し、F2000でのGA処理は別のグループ（II）を形成した。対照的に、植物ホルモンの葉面散布を行わなかった熱ストレスを受けたイネ苗（グループIとIII）（両方の遺伝子型はSC）は、グループVとは反対側のゾーンに位置しており、熱ストレスが植物生理に及ぼす影響を示している。
図 3. 発芽後 55 日 (DAE) における 2 つのイネ遺伝子型 (F67 および F2000) の植物に対する複合熱ストレス (昼/夜 40°/30°C) の影響のバイオグラフ分析。略語: AC F67、絶対コントロール F67; SC F67、熱ストレスコントロール F67; AUX F67、熱ストレス + オーキシン F67; GA F67、熱ストレス + ジベレリン F67; CK F67、熱ストレス + 細胞分裂 BR F67、熱ストレス + ブラシノステロイド。F67; AC F2000、絶対コントロール F2000; SC F2000、熱ストレスコントロール F2000; AUX F2000、熱ストレス + オーキシン F2000; GA F2000、熱ストレス + ジベレリン F2000; CK F2000、熱ストレス＋サイトカイニン、BR F2000、熱ストレス＋真鍮ステロイド；F2000。
クロロフィル含有量、気孔コンダクタンス、Fv/Fm比、CSI、MDA、RTI、プロリン含有量などの変数は、イネ遺伝子型の適応を理解し、熱ストレス下での農業戦略の影響を評価するのに役立ちます（Sarsu et al., 2018; Quintero-Calderon et al., 2021）。この実験の目的は、複合熱ストレス条件下でのイネ実生の生理学的および生化学的パラメータに対する4つの成長調節剤の適用の影響を評価することでした。実生試験は、利用可能なインフラストラクチャのサイズまたは状態に応じて、イネ植物を同時に評価するためのシンプルで迅速な方法です（Sarsu et al. 2018）。この研究の結果は、複合熱ストレスが2つのイネ遺伝子型で異なる生理学的および生化学的反応を誘発し、適応プロセスを示していることを示しました。これらの結果はまた、葉面成長調節剤（主にサイトカイニンとブラシノステロイド）がイネの複合的な熱ストレスへの適応を助けることを示しており、その効果は主にgs、RWC、Fv/Fm比、光合成色素、プロリン含有量に影響を与える。
成長調節剤の施用は、高温ストレス下にあるイネの水分状態を改善するのに役立ちます。高温ストレスは、より高いストレスと低い植物キャノピー温度に関連している可能性があります。この研究では、「F2000」（感受性遺伝子型）植物のうち、CKまたはBRを主として処理したイネは、SCで処理した植物よりもgs値が高く、PCT値が低いことが示されました。以前の研究でも、gsとPCTは、イネの適応反応と高温ストレスに対する農業戦略の影響を決定できる正確な生理学的指標であることが示されています（Restrepo-DiazおよびGarces-Varon、2013年、Sarsuら、2018年、Quintero）。-Carr DeLongら、2021年）。葉のCKまたはBRは、ストレス下でgを増加させます。これは、これらの植物ホルモンがABA（非生物的ストレス下での気孔閉鎖促進物質）などの他のシグナル伝達分子との合成相互作用を介して気孔の開口を促進することができるためです（Macková et al., 2013; Zhou et al., 2013）。 2013)。 、 2014)。気孔の開口は葉の冷却を促進し、キャノピー温度の低下に役立ちます（Sonjaroon et al., 2018; Quintero-Calderón et al., 2021）。これらの理由から、CKまたはBRを散布したイネのキャノピー温度は、複合的な熱ストレス下では低くなる可能性があります。
高温ストレスは葉の光合成色素含有量を減少させる可能性がある（Chen et al., 2017; Ahammed et al., 2018）。本研究では、イネ植物が熱ストレスを受け、植物成長調節剤を散布しなかった場合、両方の遺伝子型で光合成色素が減少する傾向が見られた（表2）。Feng et al.（2013）も、熱ストレスにさらされた2つのコムギ遺伝子型の葉のクロロフィル含有量が有意に減少したことを報告している。高温にさらされるとクロロフィル含有量が減少することが多いが、これはクロロフィル生合成の減少、色素の分解、または熱ストレス下でのそれらの複合効果によるものと考えられる（Fahad et al., 2017）。しかし、主にCKとBAで処理したイネ植物は、熱ストレス下で葉の光合成色素の濃度が増加した。同様の結果はJespersen and Huang（2015）とSuchsagunpanit et al.によっても報告されている。 （2015）は、それぞれ熱ストレスを受けたベントグラスとイネにゼアチンとエピブラシノステロイドホルモンを施用した後に葉のクロロフィル含有量が増加することを観察し。CKとBRが複合熱ストレス下で葉のクロロフィル含有量の増加を促進する合理的な説明は、CKが発現プロモーター（老化活性化プロモーター（SAG12）やHSP18プロモーターなど）の持続的誘導の開始を強化し、葉のクロロフィル損失を減らす可能性があるということである。葉の老化を遅らせ、植物の耐熱性を高める（Liu et al., 2020）。BRは、ストレス条件下でクロロフィル生合成に関与する酵素の合成を活性化または誘導することにより、葉のクロロフィルを保護し、葉のクロロフィル含有量を増加させることができる（Sharma et al., 2017; Siddiqui et al., 2018）。最後に、2つの植物ホルモン（CKとBR）は、熱ショックタンパク質の発現を促進し、クロロフィル生合成の増加など、さまざまな代謝適応プロセスを改善します（Sharma et al., 2017; Liu et al., 2020）。
クロロフィル a 蛍光パラメーターは、植物の非生物的ストレス条件に対する耐性または適応を評価できる迅速かつ非破壊的な方法を提供する (Chaerle et al. 2007; Kalaji et al. 2017)。 Fv/Fm 比などのパラメーターは、ストレス条件に対する植物の適応の指標として使用されている (Alvarado-Sanabria et al. 2017; Chavez-Arias et al. 2020)。本研究では、SC 植物がこの変数の最低値を示し、主に「F2000」イネ植物であった。 Yin et al. (2010) も、最も分げつの多いイネの葉の Fv/Fm 比が 35°C を超える温度で有意に減少することを発見した。 Feng et al. によると、 （2013）によると、熱ストレス下でのFv/Fm比の低下は、PSII反応中心による励起エネルギーの捕捉と変換の速度が低下していることを示しており、PSII反応中心が熱ストレス下で崩壊することを示唆している。この観察から、光合成装置の障害は、耐性品種（Fedearroz 67）よりも感受性品種（Fedearroz 2000）でより顕著であると結論付けることができる。
CKまたはBRの使用は、一般的に複合熱ストレス条件下でのPSIIの性能を向上させた。Suchsagunpanitら（2015）も同様の結果を得ており、BRの施用によりイネの熱ストレス下でのPSIIの効率が向上することを観察した。Kumarら（2020）もまた、CK（6-ベンジルアデニン）で処理され熱ストレスを受けたヒヨコマメ植物でFv/Fm比が増加することを発見し、ゼアキサンチン色素サイクルを活性化することによるCKの葉面施用がPSII活性を促進すると結論付けた。さらに、BRの葉面散布は複合ストレス条件下でのPSII光合成を促進し、この植物ホルモンの施用によりPSIIアンテナの励起エネルギーの散逸が減少し、葉緑体内の小型熱ショックタンパク質の蓄積が促進されることを示した（Ogwenoら 2008; KothariおよびLachowitz 2021）。
植物が非生物的ストレスにさらされると、最適な条件下で生育した植物と比較して、MDAとプロリンの含有量が増加することが多い（Alvarado-Sanabria et al. 2017）。これまでの研究では、MDAとプロリンのレベルは、昼夜を問わず高温にさらされたイネの適応プロセスや農法の影響を理解するために使用できる生化学的指標であることも示されている（Alvarado-Sanabria et al., 2017; Quintero-Calderón et al. . , 2021）。これらの研究では、MDAとプロリンの含有量は、それぞれ夜間または日中に高温にさらされたイネで高くなる傾向があることも示されている。しかし、CKとBRの葉面散布は、主に耐性遺伝子型において、MDAの減少とプロリンの増加に寄与した（Federroz 67）。 CKスプレーはサイトカイニンオキシダーゼ/デヒドロゲナーゼの過剰発現を促進し、ベタインやプロリンなどの保護化合物の含有量を増加させる（Liu et al., 2020）。BRはベタイン、糖類、アミノ酸（遊離プロリンを含む）などの浸透圧保護物質の誘導を促進し、多くの不利な環境条件下で細胞の浸透圧バランスを維持する（Kothari and Lachowiec, 2021）。
作物ストレス指数（CSI）と相対耐性指数（RTI）は、評価対象の処理がさまざまなストレス（非生物的および生物的）を軽減し、植物の生理にプラスの影響を与えるかどうかを判断するために使用されます（Castro-Duque et al., 2020; Chavez-Arias et al., 2020）。CSI 値は 0 から 1 の範囲で、それぞれ非ストレス状態とストレス状態を表します（Lee et al., 2010）。熱ストレスを受けた（SC）植物の CSI 値は 0.8 から 0.9 の範囲でした（図 2B）。これは、イネが複合ストレスによって悪影響を受けたことを示しています。しかし、BC（0.6）または CK（0.6）の葉面散布は、SC イネと比較して、主に非生物的ストレス条件下でこの指標の低下をもたらしました。 F2000植物では、SA（33.52%）と比較してCA（97.69%）とBC（60.73%）を使用した場合、RTIの増加率が高く、これらの植物成長調節剤も組成の過熱に対するイネの反応の改善に貢献していることが示されました。これらの指標は、さまざまな種でストレス状態を管理するために提案されています。Leeら（2010）が行った研究では、中程度の水ストレス下にある2つの綿品種のCSIは約0.85でしたが、十分に灌漑された品種のCSI値は0.4から0.6の範囲であり、この指標は品種の水適応の指標であると結論付けました。ストレス状態。さらに、Chavez-Ariasら（2020）は、C. elegans植物における総合的なストレス管理戦略として合成エリシターの有効性を評価し、これらの化合物を散布した植物はより高いRTI（65%）を示したことを発見しました。以上のことから、CKとBRは、これらの植物成長調節物質が生化学的および生理学的に好ましい反応を誘発するため、イネの複合的な熱ストレスに対する耐性を高めることを目的とした農業戦略とみなすことができる。
近年、コロンビアのイネ研究は、生理学的または生化学的特性を用いて、日中または夜間の高温に耐性のある遺伝子型を評価することに重点を置いてきた（Sánchez-Reinoso et al., 2014; Alvarado-Sanabria et al., 2021）。しかし、近年、同国における複合的な熱ストレス期間の影響を改善するために、総合的な作物管理を提案する上で、実用的で経済的かつ収益性の高い技術の分析がますます重要になってきている（Calderón-Páez et al., 2021; Quintero-Calderon et al., 2021）。したがって、本研究で観察された複合的な熱ストレス（日中40℃/夜間30℃）に対するイネの生理学的および生化学的反応は、CKまたはBRの葉面散布が悪影響を軽減するための適切な作物管理方法である可能性を示唆している。中程度の熱ストレス期間の影響。これらの処理により、両方のイネ遺伝子型（低CSIおよび高RTI）の耐性が向上し、複合熱ストレス下での植物の生理学的および生化学的反応の一般的な傾向が示されました。イネ植物の主な反応は、GC、総クロロフィル、クロロフィルαおよびβ、カロテノイドの含有量の減少でした。さらに、植物はPSIIの損傷（Fv/Fm比などのクロロフィル蛍光パラメーターの低下）と脂質過酸化の増加に苦しみます。一方、イネをCKおよびBRで処理すると、これらの悪影響が緩和され、プロリン含有量が増加しました（図4）。
図4. 熱ストレスと葉面散布植物成長調節剤の複合散布がイネに及ぼす影響の概念モデル。赤と青の矢印は、熱ストレスとBR（ブラシノステロイド）およびCK（サイトカイニン）の葉面散布との相互作用が生理学的および生化学的反応に及ぼす負または正の影響をそれぞれ示している。gs：気孔コンダクタンス；Total Chl：総クロロフィル含有量；Chl α：クロロフィルβ含有量；Cx+c：カロテノイド含有量；
要約すると、本研究における生理学的および生化学的反応は、Fedearroz 2000イネがFedearroz 67イネよりも複合的な熱ストレス期間に対して感受性が高いことを示しています。本研究で評価したすべての植物成長調節物質（オーキシン、ジベレリン、サイトカイニン、またはブラシノステロイド）は、複合的な熱ストレスをある程度軽減しました。しかし、サイトカイニンとブラシノステロイドは、植物の適応性をより高めました。これらの植物成長調節物質は、いずれも無施用イネと比較して、クロロフィル含有量、α-クロロフィル蛍光パラメータ、gs、およびRWCを増加させ、MDA含有量とキャノピー温度を低下させました。要約すると、植物成長調節物質（サイトカイニンとブラシノステロイド）の使用は、高温期間中の深刻な熱ストレスによって引き起こされるイネ作物のストレス状態を管理する上で有用な手段であると結論付けられます。
本研究で提示されたオリジナル資料は論文に添付されており、さらに詳しい問い合わせは責任著者までご連絡ください。
投稿日時：2024年8月8日
