茎頂分裂組織（SAM）の成長は茎の構造にとって重要である。植物ホルモンジベレリンGA は植物の成長を調整する上で重要な役割を果たしているが、SAM におけるその役割はまだ十分に解明されていない。今回、我々は DELLA タンパク質を改変し、GA 転写応答におけるその必須の調節機能を抑制しながらも、GA 認識時の分解を維持することで、GA シグナル伝達の比率測定バイオセンサーを開発した。我々は、この分解ベースのバイオセンサーが、発生中の GA レベルと細胞感知の変化を正確に記録することを実証する。我々はこのバイオセンサーを使用して、SAM における GA シグナル伝達活動をマッピングした。高い GA シグナルは、主に節間細胞の前駆細胞である器官原基間に位置する細胞に存在することを示した。さらに、機能獲得および機能喪失アプローチを使用して、GA が細胞分裂面の方向を制御し、節間の標準的な細胞組織を確立し、それによって SAM における節間の指定を促進することを実証した。
茎頂に位置する茎頂分裂組織（SAM）には、植物の生涯を通じて、その活動によって側方器官と茎節がモジュール式かつ反復的に生成される幹細胞のニッチが含まれています。これらの反復単位（植物節）はそれぞれ、節間と節の側方器官、そして葉腋の腋生分裂組織から構成されます1。植物節の成長と組織化は、発達の過程で変化します。シロイヌナズナでは、栄養成長期には節間の成長が抑制され、ロゼット葉の腋生分裂組織は休眠状態にあります。花成期への移行期には、SAMは花序分裂組織となり、伸長した節間と腋芽、茎葉の腋生の小枝、そして後には葉のない花を生成します2。葉、花、枝の発生を制御するメカニズムの解明は大きく進歩しましたが、節間の発生過程については、ほとんど解明されていません。
GAの時空間分布を理解することは、異なる組織や異なる発達段階におけるこれらのホルモンの機能をより深く理解するのに役立ちます。RGA-GFP融合タンパク質を自身のプロモーター作用下で発現させ、その分解を可視化することで、根における総GAレベルの調節に関する重要な情報が得られます15,16。しかし、RGAの発現は組織によって異なり17、GAによって調節されます18。したがって、RGAプロモーターの差次的発現がRGA-GFPで観察される蛍光パターンをもたらす可能性があり、この方法は定量的ではありません。最近では、生物活性フルオレセイン（Fl）標識GA19,20により、根の内皮質におけるGAの蓄積と、GA輸送によるその細胞レベルの調節が明らかになりました。さらに最近、GA FRETセンサーnlsGPS1により、根、花糸、暗所で生育した胚軸における細胞伸長とGAレベルが相関することが示されました21。しかし、これまで見てきたように、GA濃度はGAシグナル伝達活性を制御する唯一のパラメータではなく、複雑な感知プロセスに依存している。本稿では、DELLAおよびGAシグナル伝達経路に関する理解に基づき、GAシグナル伝達に対する分解ベースのレシオメトリックバイオセンサーの開発と特性評価を報告する。この定量バイオセンサーの開発にあたり、蛍光タンパク質に融合され組織中に遍在的に発現する変異型GA感受性RGAと、GA非感受性蛍光タンパク質を用いた。変異型RGAタンパク質融合体は、遍在的に発現した場合でも内因性GAシグナル伝達を妨げないこと、またこのバイオセンサーは、GA入力と感知装置によるGAシグナル処理の両方に起因するシグナル伝達活性を、高い時空間分解能で定量できることを示す。このバイオセンサーを用いて、GAシグナル伝達活性の時空間分布をマッピングし、SAM表皮においてGAがどのように細胞挙動を制御するかを定量化した。 GA が器官原基間に位置する SAM 細胞の分裂面の向きを制御し、それによって節間の標準的な細胞組織を定義することを実証しました。
最後に、qmRGAが成長中の胚軸を用いて内因性GA濃度の変化を報告できるかどうかを検証しました。私たちは以前、硝酸塩がGA合成を促進し、ひいてはDELLA34の分解を促進することで成長を刺激することを示しました。その結果、豊富な硝酸塩供給（10 mM NO3−）下で生育したpUBQ10::qmRGA実生の胚軸長は、硝酸塩欠乏条件下で生育した実生よりも有意に長いことを観察しました（補足図6a）。成長反応と一致して、10 mM NO3−条件下で生育した実生の胚軸におけるGAシグナルは、硝酸塩が存在しない条件下で生育した実生よりも高くなりました（補足図6b、c）。このように、qmRGAは、内因性GA濃度の変化によって引き起こされるGAシグナル伝達の変化をモニタリングすることもできます。
qmRGA によって検出された GA シグナル伝達活性が、センサー設計から予想されるように GA 濃度および GA 知覚に依存するかどうかを解明するために、栄養組織および生殖組織における 3 つの GID1 受容体の発現を解析しました。実生では、GID1-GUS レポーターラインにより、GID1a および c が子葉で高度に発現していることが示されました (図 3a–c)。さらに、3 つの受容体すべてが、葉、側根原基、根端 (GID1b の根冠を除く)、および維管束系で発現していました (図 3a–c)。花序 SAM では、GID1b および 1c のみの GUS シグナルが検出されました (補足図 7a–c)。in situ ハイブリダイゼーションによってこれらの発現パターンが確認され、さらに GID1c は SAM で均一に低レベルで発現しているのに対し、GID1b は SAM の周辺で高い発現を示すことが実証されました (補足図 7d–l)。 pGID1b::2xmTQ2-GID1b 翻訳融合遺伝子は、SAM の中心部での低発現または無発現から器官境界での高発現まで、GID1b の発現に段階的な範囲があることも明らかにしました (補足図 7m)。このように、GID1 受容体は組織全体および組織内に均一に分布しているわけではありません。その後の実験では、GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) の過剰発現により、胚軸の qmRGA の外部 GA 適用に対する感受性が上昇することも観察されました (図 3d、e)。対照的に、胚軸の qd17mRGA によって測定された蛍光は、GA3 処理に対して鈍感でした (図 3f、g)。両方のアッセイでは、GID1 受容体への結合能力が増強または消失したセンサーの急速な挙動を評価するために、実生を高濃度 GA (100 μM GA3) で処理しました。これらの結果を総合すると、qmRGA バイオセンサーは GA と GA センサーの両方の機能を果たすことが確認され、GID1 受容体の差次的発現がセンサーの放射率を大幅に調整できることが示唆されます。
現在までに、SAM における GA シグナルの分布は不明である。そこで我々は、qmRGA 発現植物と pCLV3::mCherry-NLS 幹細胞レポーター35 を使用して、SAM の成長制御に重要な役割を果たす L1 層 (表皮、図 4a、b、方法および補足方法を参照) に焦点を当てた GA シグナル伝達活性の高解像度定量マップを作成した36。ここで、pCLV3::mCherry-NLS の発現は、GA シグナル伝達活性の時空間分布を解析するための固定された幾何学的参照点を提供した37。GA は側方器官の発達に必須であると考えられているが4、我々は P3 期以降の花原基 (P) での GA シグナルが低いことを観察した (図 4a、b)。一方、若い P1 および P2 原基では中央領域と同様の中程度の活性を示した (図 4a、b)。器官原基境界では、P1/P2（境界の両側）から始まりP4でピークとなる高いGAシグナル伝達活性が検出され、また原基間に位置する周辺領域のすべての細胞でも検出されました（図4a、bおよび補足図8a、b）。この高いGAシグナル伝達活性は、表皮だけでなく、L2層および上部L3層でも観察されました（補足図8b）。qmRGAを用いてSAMで検出されたGAシグナルのパターンも、経時的に変化しませんでした（補足図8c–f、k）。qd17mRGAコンストラクトは、詳細に特徴付けた5つの独立したラインのT3植物のSAMで系統的にダウンレギュレーションされていましたが、pRPS5a::VENUS-2A-TagBFPコンストラクトで得られた蛍光パターンを分析することができました（補足図8g–j、l）。このコントロールラインでは、SAMにおける蛍光比のわずかな変化のみが検出されたが、SAM中心部ではTagBFPに関連するVENUSの明確かつ予想外の減少が観察された。これは、qmRGAによって観察されたシグナル伝達パターンがGA依存的なmRGA-VENUSの分解を反映していることを確認するものであるが、同時にqmRGAが分裂組織中心部におけるGAシグナル伝達活性を過大評価している可能性も示している。まとめると、我々の研究結果は、主に原基の分布を反映するGAシグナル伝達パターンを明らかにしている。この原基間領域（IPR）の分布は、発達中の原基と中心部の間で徐々に高いGAシグナル伝達活性が確立され、同時に原基におけるGAシグナル伝達活性が低下することに起因している（図4c、d）。
GID1b および GID1c 受容体の分布（上記参照）は、GA 受容体の示差的発現が SAM における GA シグナル伝達活性のパターン形成に寄与していることを示唆している。我々は、GA の示差的蓄積が関与しているのではないかと考えた。この可能性を調べるために、nlsGPS1 GA FRET センサー21 を使用した。10 μM GA4+7 で 100 分間処理した nlsGPS1 の SAM で活性化頻度の増加が検出され（補足図 9a–e）、これは nlsGPS1 が根の場合と同様に SAM 内の GA 濃度の変化に応答することを示している21。nlsGPS1 活性化頻度の空間分布は、SAM の外層では GA レベルが比較的低いことを明らかにしたが、SAM の中心および境界では GA レベルが高いことを示した（図 4e および補足図 9a、c）。補完的なアプローチとして、SAM を蛍光 GA（GA3-、GA4-、GA7-Fl）で処理するか、ネガティブコントロールとして Fl のみを処理しました。Fl シグナルは、低強度ではあるものの、中心領域と原基を含む SAM 全体に分布していました（図 4j および補足図 10d）。対照的に、3 つの GA-Fl はすべて原基境界内に特異的に蓄積し、IPR の残りの部分にはさまざまな程度に蓄積し、GA7-Fl は IPR で最も大きな領域に蓄積していました（図 4k および補足図 10a、b）。蛍光強度の定量化により、GA-Fl 処理 SAM では Fl 処理 SAM と比較して IPR と非 IPR の強度比が高いことが明らかになりました（図 4l および補足図 10c）。これらの結果を合わせると、器官の境界に最も近い IPR 細胞に GA がより高濃度で存在することが示唆されます。このことは、SAMにおけるGAシグナル伝達活性のパターンが、GA受容体の発現差と、器官境界近傍のIPR細胞におけるGAの蓄積差の両方に起因することを示唆している。したがって、本解析では、SAMの中心部と原基部ではGAシグナル伝達活性が低く、末梢部ではIPR細胞で活性が高いという、予想外の時空間的GAシグナル伝達パターンが明らかになった。
SAM における異なる GA シグナル伝達活性の役割を理解するために、SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS のリアルタイムタイムラプスイメージングを使用して、GA シグナル伝達活性、細胞膨張、および細胞分裂の相関関係を分析しました。 GA が成長制御に果たす役割を考慮すると、細胞膨張パラメータとの正の相関が予想されました。 そのため、最初に GA シグナル伝達活性マップを、細胞表面成長速度マップ (任意の細胞および分裂時の娘細胞の細胞膨張の強度の代理として)、および細胞膨張の方向性を測定する成長異方性マップ (ここでも任意の細胞および分裂時の娘細胞に対して使用; 図 5a、b、方法および補足方法を参照) と比較しました。 SAM 細胞表面成長速度のマップは、境界で最小の成長率、発達中の花で最大の成長率という、以前の観察結果 38,39 と一致しています (図 5a)。主成分分析（PCA）の結果、GAシグナル伝達活性は細胞表面の成長強度と負の相関関係にあることが示されました（図5c）。また、GAシグナル伝達入力や成長強度を含む変動の主軸は、CLV3発現量の増加によって決定される方向と直交していることが示され、残りの解析において細胞がSAM中心から除外されていることが確認されました。スピアマン相関分析はPCAの結果（図5d）を裏付け、IPRにおけるGAシグナルの増加が細胞増殖の増加につながらないことを示しました。しかし、相関分析の結果、GAシグナル伝達活性と成長異方性の間にはわずかな正の相関関係が示され（図5c、d）、IPRにおけるGAシグナル伝達の増加が細胞の成長方向、ひいては細胞分裂面の位置に影響を与える可能性が示唆されました。
a、b SAM の平均表面成長 (a) と成長異方性 (b) のヒートマップ。7 つの独立した植物について平均しました (それぞれ、細胞拡張の強度と方向のプロキシとして使用されます)。 c PCA 分析には、次の変数を含めました: GA シグナル、表面成長強度、表面成長異方性、および CLV3 発現。PCA コンポーネント 1 は、主に表面成長強度と負の相関があり、GA シグナルと正の相関がありました。PCA コンポーネント 2 は、主に表面成長異方性と正の相関があり、CLV3 発現と負の相関がありました。パーセンテージは、各コンポーネントによって説明される変動を表します。 d CZ を除く組織スケールでの GA シグナル、表面成長強度、および表面成長異方性の間のスピアマン相関分析。右側の数字は、2 つの変数間のスピアマンの rho 値です。アスタリスクは、相関/負の相関が非常に有意な場合を示します。 e 共焦点顕微鏡による Col-0 SAM L1 細胞の 3D 視覚化。 10時間後にSAM（原基ではない）に形成された新しい細胞壁は、角度値に応じて色分けされています。カラーバーは右下隅に表示されています。挿入図は、0時間後の対応する3D画像を示しています。実験は2回繰り返され、同様の結果が得られました。f ボックスプロットは、IPRおよび非IPR Col-0 SAM（n = 10個の独立した植物）における細胞分裂率を示しています。中心線は中央値、ボックスの境界は25パーセンタイルと75パーセンタイルを示しています。ヒゲは、Rソフトウェアで決定された最小値と最大値を示しています。P値は、Welchの両側t検定によって取得されました。 g、h （g）SAMの中心（白点線）からの放射状方向に対する新しい細胞壁（マゼンタ）の角度の測定方法（鋭角値、すなわち0～90°のみを考慮）、および（h）分裂組織内の円周方向／横方向と放射状方向を示す模式図。i SAM（濃い青）、IPR（中間の青）、非IPR（薄い青）全体の細胞分裂面の向きの頻度ヒストグラム。P値は、両側コルモゴロフ・スミルノフ検定によって得られた。実験は2回繰り返され、同様の結果が得られた。j それぞれP3（薄い緑）、P4（中間の緑）、P5（濃い緑）の周りのIPRの細胞分裂面の向きの頻度ヒストグラム。P値は、両側コルモゴロフ・スミルノフ検定によって得られた。実験は2回繰り返され、同様の結果が得られた。
そこで次に、アッセイ中に新たに形成された細胞壁を同定することにより、GAシグナル伝達と細胞分裂活性の相関関係を調査しました（図5e）。このアプローチにより、細胞分裂の頻度と方向を測定することができました。驚くべきことに、IPR細胞とSAMの残りの部分（非IPR、図5f）の細胞分裂頻度は類似しており、IPR細胞と非IPR細胞間のGAシグナル伝達の違いは細胞分裂に有意な影響を与えないことが示されました。このこと、そしてGAシグナル伝達と成長異方性との正の相関関係から、GAシグナル伝達活性が細胞分裂面の向きに影響を与える可能性があるかどうかを検討することにしました。新生細胞壁の配向を、分裂組織中心と新生細胞壁中心を結ぶ放射軸に対する鋭角として測定した（図5e-i）。その結果、細胞は放射軸に対して90°に近い角度で分裂する明確な傾向が観察され、最も高い頻度は70～80°（23.28%）および80～90°（22.62%）であった（図5e,i）。これは円周方向および横方向への細胞分裂に対応している（図5h）。この細胞分裂挙動へのGAシグナル伝達の寄与を調べるため、IPRと非IPRにおける細胞分裂パラメータを個別に解析した（図5i）。 IPR 細胞の分裂角度分布は、非 IPR 細胞や SAM 全体の細胞の分布とは異なり、IPR 細胞では側方/円形細胞分裂の割合が高く、70–80° と 80–90° (それぞれ 33.86% と 30.71%) であることが観察されました (図 5i)。このように、私たちの観察から、GA シグナル伝達の亢進と細胞分裂面の向きが円周方向に近いこととの間に関連性があることが明らかになりました。これは、GA シグナル伝達活性と成長異方性との相関関係に似ています (図 5c、d)。この関連の空間的保存性をさらに確立するために、P3 から始まる原基を取り囲む IPR 細胞の分裂面の向きを測定した結果、この領域では P4 から最も高い GA シグナル伝達活性が検出された (図 4)。 P3およびP4付近のIPRの分裂角度には統計的に有意な差は見られなかったが、P4付近のIPRでは側方細胞分裂の頻度が増加していた（図5j）。しかし、P5付近のIPR細胞では、細胞分裂面の配向に統計的に有意な差が見られ、横方向細胞分裂の頻度が急激に増加した（図5j）。これらの結果を総合すると、GAシグナル伝達がSAMにおける細胞分裂の配向を制御できることが示唆され、これは、GAシグナル伝達の亢進がIPRにおける細胞分裂の側方配向を誘導するという過去の報告40,41と一致する。
IPRの細胞は原基ではなく節間へ取り込まれると予測されています2,42,43。IPRにおける細胞分裂の横方向への配向は、節間において表皮細胞が縦方向に平行に並ぶ典型的な構造を形成する可能性があります。上記の観察結果は、GAシグナル伝達が細胞分裂の方向を制御することで、この過程において役割を果たしている可能性を示唆しています。
いくつかの DELLA 遺伝子の機能喪失は恒常的な GA 応答をもたらし、della 変異体はこの仮説を検証するために使用できます44。私たちはまず、SAM における 5 つの DELLA 遺伝子の発現パターンを分析しました。GUS ラインの転写融合45 により、SAM で GAI、RGA、RGL1、および RGL2（はるかに低いレベル）が発現していることが明らかになりました（補足図 11a–d）。in situ ハイブリダイゼーションにより、さらに GAI mRNA が原基と発達中の花に特異的に蓄積することが実証されました（補足図 11e）。RGL1 および RGL3 mRNA は SAM の樹冠全体と古い花で検出されたのに対し、RGL2 mRNA は境界領域でより豊富でした（補足図 11f–h）。 pRGL3::RGL3-GFP SAMの共焦点イメージングにより、in situハイブリダイゼーションで観察された発現が確認され、RGL3タンパク質がSAMの中央部に蓄積していることが示されました（補足図11i）。pRGA::GFP-RGAラインを用いた解析では、RGAタンパク質がSAMに蓄積するものの、P4を境にその存在量が減少していることも確認されました（補足図11j）。特に、RGL3とRGAの発現パターンは、qmRGAによって検出されたIPRにおけるGAシグナル伝達活性の上昇と一致しています（図4）。さらに、これらのデータは、すべてのDELLAがSAMで発現しており、それらの発現がSAM全体に及んでいることを示しています。
次に、野生型SAM（Ler、コントロール）とgai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della五重変異体（グローバル）の細胞分裂パラメータを解析した（図6a、b）。興味深いことに、dellaグローバル変異体SAMでは、野生型と比較して細胞分裂角度頻度の分布に統計的に有意な変化が認められた（図6c）。dellaグローバル変異体におけるこの変化は、80～90°角度頻度の増加（34.71% vs. 24.55%）と、それよりは程度は低いものの70～80°角度頻度の増加（23.78% vs. 20.18%）によるものであり、これらは横方向の細胞分裂に相当する（図6c）。 della global変異体では、非横断分裂（0～60°）の頻度も低下した（図6c）。della global変異体のSAMにおける横断細胞分裂の頻度は有意に増加した（図6b）。IPRにおける横断細胞分裂の頻度も、della global変異体では野生型と比較して高かった（図6d）。IPR領域以外では、野生型は細胞分裂角度の分布がより均一であったのに対し、della global変異体はIPRと同様に接線方向の分裂を好んだ（図6e）。また、GAが蓄積するGA不活性変異体であるga2酸化酵素（ga2ox）5重変異体（ga2ox1-1、ga2ox2-1、ga2ox3-1、ga2ox4-1、およびga2ox6-2）のSAMにおける細胞分裂の方向を定量化した。 GAレベルの増加と一致して、5重ga2ox変異体花序のSAMはCol-0よりも大きくなっていました（補足図12a、b）。また、Col-0と比較して、5重ga2ox SAMは細胞分裂角度の分布が明確に異なり、角度頻度は50°から90°に増加しました。つまり、接線方向の分裂が再び促進されたのです（補足図12a–c）。このように、GAシグナル伝達の恒常的活性化とGA蓄積は、IPRおよびSAMの残りの部分において側方細胞分裂を誘導することを示しています。
a、b 共焦点顕微鏡を使用した、PI染色したLer（a）およびglobal della変異体（b）SAMのL1層の3D視覚化。10時間にわたってSAM（原基ではない）に形成された新しい細胞壁が表示され、角度の値に応じて色分けされています。挿入図は0時間のSAMを示しています。カラーバーは右下隅に表示されます。（b）の矢印は、global della変異体の整列した細胞ファイルの例を示しています。実験は2回繰り返され、同様の結果が得られました。ce Lerとglobal dellaのSAM全体（d）、IPR（e）、および非IPR（f）における細胞分裂面の向きの頻度分布の比較。P値は両側Kolmogorov-Smirnov検定を使用して取得されました。 f、g Col-0（i）およびpCUC2::gai-1-VENUS（j）トランスジェニック植物のPI染色SAMの共焦点画像の3D可視化。パネル（a、b）は、10時間以内にSAMに形成された新しい細胞壁（原基ではない）を示しています。実験は2回繰り返され、同様の結果が得られました。h–j Col-0とpCUC2::gai-1-VENUS植物のSAM全体（h）、IPR（i）、および非IPR（j）に位置する細胞分裂面の向きの頻度分布の比較。P値は両側コルモゴロフ・スミルノフ検定を使用して取得されました。
次に、IPR で特異的に GA シグナル伝達を阻害する効果を検証しました。このために、子葉カップ 2 (CUC2) プロモーターを使用して、VENUS に融合した優性負性 gai-1 タンパク質の発現を促進しました (pCUC2::gai-1-VENUS ライン)。野生型 SAM では、CUC2 プロモーターは P4 以降、境界細胞を含む SAM 内のほとんどの IPR の発現を促進し、pCUC2::gai-1-VENUS 植物でも同様の特異的発現が観察されました (以下を参照)。pCUC2::gai-1-VENUS 植物の SAM または IPR 上の細胞分裂角度の分布は、野生型と有意に異なりませんでしたが、予想外にも、これらの植物で IPR を持たない細胞は 80～90° という高い頻度で分裂することがわかりました (図 6f～j)。
細胞分裂の方向はSAMの形状、特に組織の湾曲によって生じる引張応力に依存することが示唆されている46。そこで我々は、della global変異体およびpCUC2::gai-1-VENUS植物でSAMの形状が変化するかどうかを調べた。以前の報告12のとおり、della global変異体のSAMのサイズは野生型よりも大きかった（補足図13a、b、d）。CLV3およびSTM RNAのin situハイブリダイゼーションにより、della変異体における分裂組織の拡大が確認され、さらに幹細胞ニッチの横方向の拡大が示された（補足図13e、f、h、i）。しかし、SAMの湾曲は両方の遺伝子型で同様であった（補足図13k、m、n、p）。 gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della四重変異体では、野生型と比較して曲率の変化なしに同様のサイズの増加が観察されました（補足図13c、d、g、j、l、o、p）。細胞分裂方向の頻度もdella四重変異体で影響を受けましたが、dellaモノリス変異体よりも程度は低かったです（補足図12d～f）。この用量効果は、曲率への影響がないことと合わせて、Della四重変異体における残存RGL3活性がDELLA活性の喪失によって引き起こされる細胞分裂方向の変化を制限し、側方細胞分裂の変化はSAM形状の変化ではなくGAシグナル伝達活性の変化に反応して起こることを示唆しています。上述のように、CUC2 プロモーターは P4 から SAM で IPR の発現を促進します (補足図 14a、b)。これとは対照的に、pCUC2::gai-1-VENUS SAM はサイズが縮小しましたが、曲率が高くなっています (補足図 14c～h)。この pCUC2::gai-1-VENUS SAM の形態変化により、SAM 中心からより近い距離で高い円周方向の応力が始まる野生型と比較して、機械的応力の分布が異なる可能性があります47。あるいは、pCUC2::gai-1-VENUS SAM の形態変化は、トランスジーン発現によって誘導される局所的な機械的特性の変化によって生じている可能性もあります48。いずれの場合も、これが円周方向/横方向の方向で細胞分裂を起こす可能性を高めることで、GA シグナル伝達の変化の影響を部分的に相殺する可能性があり、これが今回の観察結果を説明しています。
以上のデータを総合すると、高次GAシグナル伝達がIPRにおける細胞分裂面の横方向の配向に積極的な役割を果たしていることが裏付けられます。また、分裂組織の湾曲もIPRにおける細胞分裂面の配向に影響を与えることが示されています。
IPRにおける分裂面の横方向配向は、GAシグナル伝達活性が高いことに起因することから、GAがSAM内の表皮に放射状の細胞列を前もって組織化し、後に表皮節間に見られる細胞組織を規定していることを示唆している。実際、このような細胞列はdella global変異体のSAM画像において頻繁に観察された（図6b）。そこで、SAMにおけるGAシグナル伝達の空間パターンの発生的機能をさらに探るため、野生型（LerおよびCol-0）、della global変異体、およびpCUC2::gai-1-VENUSトランスジェニック植物のIPRにおける細胞の空間的組織化を、タイムラプスイメージングを用いて解析した。
qmRGA により、IPR の GA シグナル伝達活性は P1/P2 から増加して P4 でピークに達し、このパターンは時間とともに一定のままであることが分かりました (図 4a–f および補足図 8c–f、k)。 GA シグナルが増加する IPR 内の細胞の空間的構成を分析するために、最初の観察から 34 時間後、すなわち 2 プラスチド時間以上後に分析した発生運命に従って、P4 の上方および側方の Ler IPR 細胞にラベルを付けました。これにより、P1/P2 から P4 までの原基発生中の IPR 細胞を追跡できるようになりました。3 つの異なる色を使用しました。P4 付近の原基に統合された細胞には黄色、IPR にあった細胞には緑、両方のプロセスに参加した細胞には紫です (図 7a–c)。t0 (0 時間) では、P4 の前に 1–2 層の IPR 細胞が見えました (図 7a)。予想通り、これらの細胞は主に横方向の分裂面を介して分裂した（図7a～c）。Col-0 SAM（LerのP4と同様に境界が折り畳まれるP3に着目）を用いても同様の結果が得られたが、この遺伝子型では花の境界に形成される折り畳みによってIPR細胞がより早く隠蔽された（図7g～i）。このように、IPR細胞の分裂パターンは、節間と同様に、細胞を放射状の列に予め組織化する。放射状の列の組織化と、連続する器官間のIPR細胞の局在は、これらの細胞が節間前駆細胞であることを示唆している。
今回、我々はGAシグナル伝達バイオセンサーであるqmRGAを開発しました。このバイオセンサーは、GAとGA受容体の濃度の組み合わせから生じるGAシグナル伝達活性の定量マッピングを可能にし、内因性シグナル伝達経路への干渉を最小限に抑えることで、細胞レベルでのGA機能に関する情報を提供します。この目的のために、我々は、DELLA相互作用パートナーへの結合能力を失っているものの、GA誘導性タンパク質分解に対する感受性を維持する改変型DELLAタンパク質であるmRGAを構築しました。qmRGAは、GAレベルの外因性および内因性の両方の変化に応答し、その動的センシング特性により、発生中のGAシグナル伝達活性の時空間的変化を評価することができます。qmRGAはまた、発現に使用するプロモーターを必要に応じて変更することでさまざまな組織に適応させることができるため、非常に柔軟なツールです。また、被子植物全体でGAシグナル伝達経路とPFYREモチーフが保存されていることから、他の種にも転用できる可能性があります22。これに一致して、イネSLR1 DELLAタンパク質（HYY497AAA）の同等の変異も、mRGA23と同様に、SLR1の成長抑制活性を抑制しながら、GAを介した分解をわずかに減少させることが示されています。注目すべきことに、最近のシロイヌナズナの研究では、PFYREドメイン（S474L）の1つのアミノ酸変異が、転写因子パートナーと相互作用する能力に影響を与えることなく、RGAの転写活性を変化させました50。この変異はmRGAに存在する3つのアミノ酸置換に非常に近いですが、私たちの研究は、これら2つの変異がDELLAの異なる特性を変化させることを示しています。ほとんどの転写因子パートナーはDELLAのLHR1およびSAWドメインに結合しますが26,51、PFYREドメイン内のいくつかの保存されたアミノ酸は、これらの相互作用を安定化させるのに役立つ可能性があります。
節間発達は、植物の構造と収量向上における重要な形質です。qmRGA により、IPR 節間前駆細胞で GA シグナル伝達活性が高まっていることが明らかになりました。定量的イメージングと遺伝学を組み合わせることで、GA シグナル伝達パターンが SAM 表皮で円形/横断方向の細胞分裂面を重ね合わせ、節間発達に必要な細胞分裂組織を形成することを示しました。発達過程において、細胞分裂面の配向を制御するいくつかの因子が同定されています52,53。私たちの研究は、GA シグナル伝達活性がこの細胞パラメータを制御する方法の明確な例を提供します。DELLA はプレフォールディングタンパク質複合体と相互作用できるため41、GA シグナル伝達は表層微小管の配向に直接影響を与えることで細胞分裂面の配向を制御している可能性があります40,41,54,55。私たちは予想外に、SAM において GA シグナル伝達活性の高まりと相関するのは細胞の伸長や分裂ではなく、成長の異方性のみであることを示しました。これは、GA が IPR における細胞分裂の方向に直接影響を与えることと一致しています。しかし、この効果が間接的である可能性も排除できません。例えば、GA誘発性の細胞壁軟化56 が介在しています。細胞壁の特性変化は機械的ストレス57,58 を引き起こし、これが表層微小管の配向に影響を与えることで細胞分裂面の配向にも影響を及ぼす可能性があります39,46,59。GA誘発性の機械的ストレスとGAによる微小管配向の直接制御の複合効果は、IPRにおける特定の細胞分裂配向パターンの生成に関与し、節間を定義する可能性があり、この考えを検証するにはさらなる研究が必要です。同様に、以前の研究では、DELLA相互作用タンパク質TCP14および15が節間形成の制御において重要であることが強調されており60,61、これらの因子は、節間の発達を制御し、GAシグナル伝達に影響を及ぼすことが示されているBREVIPEDICELLUS (BP)およびPENNYWISE (PNY)とともに、GAの作用を媒介している可能性があります2,62。 DELLA がブラシノステロイド、エチレン、ジャスモン酸、アブシジン酸 (ABA) シグナル伝達経路と相互作用し63,64、これらのホルモンが微小管の方向に影響を与える可能性があることを踏まえると65、GA の細胞分裂方向への影響は他のホルモンによっても媒介される可能性があります。
初期の細胞学的研究では、シロイヌナズナSAMの内側領域と外側領域の両方が節間の発達に必要であることが示されています2,42。GAが内側組織における細胞分裂を活発に制御するという事実12は、GAがSAMにおける分裂組織と節間のサイズを制御するという二重の機能を持つことを裏付けています。方向性のある細胞分裂のパターンもSAM内側組織において厳密に制御されており、この制御は茎の成長に不可欠です52。GAがSAM内側組織における細胞分裂面の方向付けにも役割を果たし、それによってSAM内の節間の分化と発達を同期させているかどうかを調べることは興味深いでしょう。
植物は、標準条件（16時間光照射、22℃）下で、土壌または1%ショ糖および1%寒天（Sigma社）を添加した1倍ムラシゲ・スクーグ（MS）培地（Duchefa社製）を用いてin vitroで培養した。ただし、胚軸および根の成長実験では、実生を垂直プレート上で一定光照射および22℃で培養した。硝酸塩実験では、適切な硝酸塩（0または10 mM KNO3）、0.5 mMコハク酸アンモニウム、1%ショ糖、および1% A寒天（Sigma社製）を添加した改良MS培地（bioWORLD植物培地）を用いて、長日条件下で植物を培養した。
pDONR221に挿入されたGID1a cDNAは、pDONR P4-P1R-pUBQ10およびpDONR P2R-P3-mCherryと組み合わされ、pB7m34GWに組み入れられ、pUBQ10::GID1a-mCherryが作製された。pDONR221に挿入されたIDD2 DNAはpB7RWG266に組み入れられ、p35S:IDD2-RFPが作製された。 pGID1b::2xmTQ2-GID1b を生成するために、まず GID1b コード領域の上流 3.9 kb の断片と、GID1b cDNA (1.3 kb) およびターミネーター (3.4 kb) を含む 4.7 kb の断片を補足表 3 のプライマーを使用して増幅し、次にそれぞれ pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) と pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) に挿入し、最後に Gateway クローニングを使用して pGreen 012567 ターゲット ベクターに pDONR221 2xmTQ268 と組み換えました。 pCUC2::LSSmOrangeを生成するために、CUC2プロモーター配列（ATGの3229 bp上流）に続いて、N7核局在シグナルおよびNOS転写終結因子を含むラージストークスシフトmOrange（LSSmOrange）69のコード配列を、Gateway 3フラグメント組換えシステム（Invitrogen）を用いてpGreenカナマイシンターゲティングベクターに組み込んだ。この植物バイナリーベクターをAgrobacterium tumefaciens株GV3101に導入し、Agrobacterium浸潤法によってNicotiana benthamianaの葉に、花浸漬法によってArabidopsis thaliana Col-0にそれぞれ導入した。pUBQ10::qmRGA、pUBQ10::GID1a-mCherry、およびpCLV3::mCherry-NLS qmRGAは、それぞれの交配種のF3子孫およびF1子孫から単離した。
RNA in situハイブリダイゼーションは、長さ約1cmのシュート先端72を用いて行った。シュート先端は採取後、4℃に予冷したFAA溶液（3.7%ホルムアルデヒド、5%酢酸、50%エタノール）で直ちに固定した。15分間の真空処理を2回行った後、固定液を交換し、サンプルを一晩インキュベートした。GID1a、GID1b、GID1c、GAI、RGL1、RGL2、およびRGL3 cDNAおよびそれらの3'-UTRに対するアンチセンスプローブは、Rosierら73によって記載されたように、補足表3に示すプライマーを用いて合成した。ジゴキシゲニン標識プローブは、ジゴキシゲニン抗体（3000 倍希釈、Roche、カタログ番号：11 093 274 910）を使用して免疫検出され、切片は 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸（BCIP、250 倍希釈）/ニトロブルーテトラゾリウム（NBT、200 倍希釈）溶液で染色されました。
投稿日時: 2025年2月10日