茎頂分裂組織（SAM）の成長は茎の構造にとって重要である。植物ホルモンジベレリンジベレリン（GA）は植物の成長を調整する上で重要な役割を果たしますが、茎頂分裂組織（SAM）におけるその役割は未だ十分に解明されていません。本研究では、GA転写応答における必須の調節機能を抑制しつつ、GA認識時の分解を維持するようにDELLAタンパク質を改変することで、GAシグナル伝達の比率測定バイオセンサーを開発しました。この分解ベースのバイオセンサーが、発生過程におけるGAレベルと細胞感知の変化を正確に記録できることを示しました。このバイオセンサーを用いてSAMにおけるGAシグナル伝達活性をマッピングしました。その結果、高いGAシグナルは主に節間細胞の前駆細胞である器官原基間に位置する細胞に存在することが明らかになりました。機能獲得および機能喪失アプローチを用いて、GAが細胞分裂面の方向を制御し、節間の標準的な細胞組織を確立することで、SAMにおける節間分化を促進することも示しました。
茎頂分裂組織（SAM）は茎頂に位置し、幹細胞のニッチを含んでおり、その活動によって植物の生涯を通じて側方器官と茎節がモジュール式かつ反復的に生成される。これらの繰り返し単位、すなわち植物節はそれぞれ、節間と節の側方器官、および葉腋の腋芽分裂組織を含む1。植物節の成長と組織は発生中に変化する。シロイヌナズナでは、栄養成長期には節間成長が抑制され、腋芽分裂組織はロゼット葉の腋で休眠状態にある。開花期への移行期には、SAMは花序分裂組織となり、伸長した節間と腋芽、茎葉の腋の小枝、そして後には葉のない花を生成する2。葉、花、枝の形成を制御するメカニズムの理解には大きな進歩があったが、節間がどのように発生するかについては比較的ほとんど知られていない。
GAの時空間分布を理解することは、異なる組織および異なる発生段階におけるこれらのホルモンの機能をよりよく理解するのに役立つ。自身のプロモーターの作用下で発現されるRGA-GFP融合タンパク質の分解を可視化することで、根における総GAレベルの調節に関する重要な情報が得られる15,16。しかし、RGAの発現は組織によって異なり17、GAによって調節される18。したがって、RGAプロモーターの異なる発現がRGA-GFPで観察される蛍光パターンをもたらす可能性があり、この方法は定量的ではない。より最近では、生物活性フルオレセイン（Fl）標識GA19,20により、根の内皮質におけるGAの蓄積と、GA輸送による細胞内レベルの調節が明らかになった。最近では、GA FRETセンサーnlsGPS1により、GAレベルが根、フィラメント、および暗所で生育した胚軸の細胞伸長と相関することが示された21。しかし、これまで見てきたように、GA濃度はGAシグナル伝達活性を制御する唯一のパラメータではなく、複雑な感知プロセスに依存しています。本稿では、DELLAおよびGAシグナル伝達経路に関する我々の理解に基づいて、GAシグナル伝達のための分解ベースの比率測定バイオセンサーの開発と特性評価について報告します。この定量バイオセンサーを開発するために、蛍光タンパク質に融合され、組織で普遍的に発現する変異型GA感受性RGAと、GA非感受性蛍光タンパク質を使用しました。変異型RGAタンパク質融合体は、普遍的に発現しても内因性GAシグナル伝達を妨害しないこと、そしてこのバイオセンサーは、GA入力と感知装置によるGAシグナル処理の両方から生じるシグナル伝達活性を高い時空間分解能で定量化できることを示しました。このバイオセンサーを使用して、GAシグナル伝達活性の時空間分布をマッピングし、GAがSAM表皮の細胞挙動をどのように制御するかを定量化しました。我々は、GAが器官原基間に位置するSAM細胞の分裂面の方向を制御し、それによって節間部の典型的な細胞組織を規定することを実証した。
最後に、qmRGAが成長中の胚軸を用いて内因性GAレベルの変化を報告できるかどうかを検討した。我々は以前、硝酸塩がGA合成を増加させ、ひいてはDELLA34分解を増加させることで成長を促進することを示した。そこで、硝酸塩が豊富な条件下（10 mM NO3−）で生育したpUBQ10::qmRGA実生の胚軸長は、硝酸塩欠乏条件下で生育した実生の胚軸長よりも有意に長かった（補足図6a）。成長反応と一致して、10 mM NO3−条件下で生育した実生の胚軸におけるGAシグナルは、硝酸塩が存在しない条件下で生育した実生の胚軸におけるGAシグナルよりも高かった（補足図6b、c）。したがって、qmRGAは内因性GA濃度の変化によって誘発されるGAシグナル伝達の変化をモニタリングすることも可能である。
qmRGA によって検出される GA シグナル活性が、センサー設計に基づいて予想されるように GA 濃度と GA 認識に依存するかどうかを理解するために、栄養組織と生殖組織における 3 つの GID1 受容体の発現を分析しました。実生では、GID1-GUS レポーター ラインは、子葉で GID1a と c が高発現していることを示しました (図 3a–c)。さらに、3 つの受容体すべてが、葉、側根原基、根端 (GID1b の根冠を除く)、および維管束系で発現していました (図 3a–c)。花序 SAM では、GID1b と 1c の GUS シグナルのみが検出されました (補足図 7a–c)。in situ ハイブリダイゼーションにより、これらの発現パターンが確認され、さらに GID1c は SAM で均一に低レベルで発現しているのに対し、GID1b は SAM の周辺で高発現していることが示されました (補足図 7d–l)。 pGID1b::2xmTQ2-GID1b翻訳融合体では、SAMの中心部では発現が低いか全くないところから、器官の境界では発現が高いところまで、GID1bの発現に段階的な範囲があることも明らかになった（補足図7m）。したがって、GID1受容体は組織全体および組織内で均一に分布しているわけではない。その後の実験では、GID1の過剰発現（pUBQ10::GID1a-mCherry）によって、胚軸におけるqmRGAの外部GA適用に対する感受性が増加することも観察された（図3d、e）。対照的に、胚軸におけるqd17mRGAで測定した蛍光はGA3処理に対して感受性を示さなかった（図3f、g）。両方のアッセイで、実生を高濃度のGA（100 μM GA3）で処理し、GID1受容体への結合能力が増強または消失するセンサーの迅速な挙動を評価した。これらの結果を総合すると、qmRGAバイオセンサーはGAセンサーとGAセンサーの両方の機能を兼ね備えていることが確認され、GID1受容体の発現量の違いによってセンサーの発光特性が大きく変化することが示唆される。
現在まで、SAMにおけるGAシグナルの分布は不明のままである。そこで、qmRGAを発現する植物とpCLV3::mCherry-NLS幹細胞レポーター35を用いて、GAシグナル活性の高解像度定量マップを計算した。L1層（表皮、図4a、b、方法および補足方法を参照）に焦点を当てたのは、L1層がSAMの成長制御において重要な役割を果たしているためである36。ここで、pCLV3::mCherry-NLSの発現は、GAシグナル活性の時空間分布を解析するための固定された幾何学的基準点を提供した37。GAは側方器官の発達に不可欠であると考えられているが4、P3段階から花原基（P）におけるGAシグナルは低く（図4a、b）、若いP1およびP2原基では中央領域と同様の中程度の活性が見られた（図4a、b）。 GAシグナル活性は、器官原基の境界でより高く検出され、P1/P2 (境界の両側) から始まり、P4 でピークに達し、原基間に位置する周辺領域のすべての細胞でも検出されました (図 4a、b および補足図 8a、b)。この高いGAシグナル活性は、表皮だけでなく、L2 層と上部 L3 層でも観察されました (補足図 8b)。qmRGA を使用して SAM で検出された GA シグナルのパターンも、時間の経過とともに変化しませんでした (補足図 8c–f、k)。詳細に解析した 5 つの独立した系統の T3 植物の SAM では qd17mRGA コンストラクトが系統的にダウンレギュレーションされていましたが、pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP コンストラクトで得られた蛍光パターンを解析することができました (補足図 8g–j、l)。このコントロールラインでは、SAM で蛍光比にわずかな変化しか検出されませんでしたが、SAM の中心では、TagBFP に関連する VENUS の明確かつ予想外の減少が観察されました。これは、qmRGA によって観察されたシグナルパターンが mRGA-VENUS の GA 依存性分解を反映していることを確認するものですが、qmRGA が分裂組織の中心で GA シグナル活性を過大評価している可能性も示しています。要約すると、我々の結果は、主に原基の分布を反映する GA シグナルパターンを明らかにしています。この原基間領域 (IPR) の分布は、発達中の原基と中心領域の間で高 GA シグナル活性が徐々に確立されることによるものであり、同時に原基内の GA シグナル活性は減少します (図 4c、d)。
GID1bおよびGID1c受容体の分布（上記参照）は、GA受容体の差次的発現がSAMにおけるGAシグナル伝達活性のパターン形成に寄与していることを示唆している。我々は、GAの差次的蓄積が関与しているのではないかと考えた。この可能性を調査するために、nlsGPS1 GA FRETセンサー21を使用した。10 μM GA4+7で100分間処理したnlsGPS1のSAMで活性化頻度の増加が検出された（補足図9a～e）。これは、nlsGPS1が根の場合と同様にSAMにおけるGA濃度の変化に反応することを示している21。nlsGPS1活性化頻度の空間分布は、SAMの外層ではGAレベルが比較的低いが、SAMの中央部と境界部では高いことを示した（図4eおよび補足図9a、c）。これは、GAがqmRGAによって明らかになったものと同等の空間パターンでSAMにも分布していることを示唆している。補完的なアプローチとして、SAMを蛍光標識GA（GA3-、GA4-、GA7-Fl）またはネガティブコントロールとしてFl単独で処理しました。Flシグナルは、強度は低いものの、中央領域と原基を含むSAM全体に分布していました（図4jおよび補足図10d）。対照的に、3種類のGA-Flはすべて原基境界内に特異的に蓄積し、IPRの残りの部分にはさまざまな程度で蓄積しました。GA7-FlはIPRの最大の領域に蓄積しました（図4kおよび補足図10a、b）。蛍光強度の定量化により、GA-Fl処理SAMでは、Fl処理SAMと比較して、IPRと非IPRの強度比が高いことが明らかになりました（図4lおよび補足図10c）。これらの結果を総合すると、GAは器官境界に最も近いIPR細胞に高濃度で存在することが示唆されます。このことから、SAMにおけるGAシグナル伝達活性のパターンは、GA受容体の発現量の違いと、器官境界付近のIPR細胞におけるGAの蓄積量の違いの両方に起因すると考えられる。したがって、我々の解析により、SAMの中心部および原基部では活性が低く、周辺部のIPRでは活性が高いという、予想外の時空間的なGAシグナル伝達パターンが明らかになった。
SAMにおけるGAシグナル伝達活性の差異の役割を理解するために、SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLSのリアルタイムタイムラプスイメージングを使用して、GAシグナル伝達活性、細胞膨張、および細胞分裂の相関関係を分析しました。成長制御におけるGAの役割を考えると、細胞膨張パラメータとの正の相関が予想されました。そこで、まずGAシグナル伝達活性マップを、細胞表面成長速度マップ（特定の細胞および分裂時の娘細胞の細胞膨張の強さの代理として）および細胞膨張の方向性を測定する成長異方性マップ（これも特定の細胞および分裂時の娘細胞に使用；図5a、b、方法および補足方法を参照）と比較しました。SAM細胞表面成長速度のマップは、境界で最小の成長速度、発達中の花で最大の成長速度という以前の観察38、39と一致しています（図5a）。主成分分析（PCA）では、GAシグナル活性が細胞表面の成長強度と負の相関関係にあることが示されました（図5c）。また、GAシグナル入力と成長強度を含む変動の主軸が、高CLV3発現によって決定される方向と直交していることも示され、残りの分析でSAM中心からの細胞が除外されていることが確認されました。スピアマン相関分析はPCAの結果を確認し（図5d）、IPRにおけるGAシグナルの増加が細胞膨張の増加にはつながらないことを示しました。しかし、相関分析ではGAシグナル活性と成長異方性の間にわずかな正の相関関係が明らかになり（図5c、d）、IPRにおけるGAシグナルの増加が細胞成長の方向、ひいては細胞分裂面の位置に影響を与える可能性が示唆されました。
a、b SAM における平均表面成長 (a) および成長異方性 (b) のヒートマップ。7 つの独立した植物で平均化 (それぞれ細胞拡張の強度と方向の代理として使用)。 c PCA 分析には、GA シグナル、表面成長強度、表面成長異方性、および CLV3 発現という変数が含まれています。PCA 成分 1 は主に表面成長強度と負の相関があり、GA シグナルと正の相関がありました。PCA 成分 2 は主に表面成長異方性と正の相関があり、CLV3 発現と負の相関がありました。パーセンテージは、各成分によって説明される変動を表します。 d CZ を除く組織スケールでの GA シグナル、表面成長強度、および表面成長異方性の間のスピアマン相関分析。右側の数字は、2 つの変数間のスピアマンの rho 値です。アスタリスクは、相関/負の相関が非常に有意なケースを示します。 e 共焦点顕微鏡による Col-0 SAM L1 細胞の 3D 可視化。 10 時間目に SAM で形成された新しい細胞壁 (原基ではない) は、その角度の値に応じて色分けされています。カラー バーは右下隅に表示されています。挿入図は、0 時間目の対応する 3D 画像を示しています。実験は 2 回繰り返され、同様の結果が得られました。f ボックス プロットは、IPR および非 IPR Col-0 SAM の細胞分裂率 (n = 10 個の独立した植物) を示しています。中央の線は中央値を示し、ボックスの境界は 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルを示します。ひげは、R ソフトウェアで決定された最小値と最大値を示します。P 値は、ウェルチの両側 t 検定で得られました。 g、h SAMの中心（白い点線）からの半径方向に対する新しい細胞壁（マゼンタ）の角度の測定方法（鋭角の値、つまり0～90°のみを考慮）、および分裂組織内の円周方向/側方方向と半径方向を示す模式図。 i SAM（濃い青）、IPR（中程度の青）、および非IPR（薄い青）を横切る細胞分裂面の向きの頻度ヒストグラム。P値は両側コルモゴロフ・スミルノフ検定によって得られた。実験は同様の結果で2回繰り返された。 j P3（薄い緑）、P4（中程度の緑）、およびP5（濃い緑）の周りのIPRの細胞分裂面の向きの頻度ヒストグラム。P値は両側コルモゴロフ・スミルノフ検定によって得られた。実験は同様の結果で2回繰り返された。
そこで、次に、アッセイ中に新たに形成された細胞壁を特定することにより、GAシグナル伝達と細胞分裂活性との相関関係を調査した（図5e）。このアプローチにより、細胞分裂の頻度と方向を測定することができた。驚くべきことに、IPRとSAMの残りの部分（非IPR、図5f）における細胞分裂の頻度は類似しており、IPR細胞と非IPR細胞間のGAシグナル伝達の違いは細胞分裂に大きな影響を与えないことがわかった。このことと、GAシグナル伝達と成長異方性の間の正の相関関係から、GAシグナル伝達活性が細胞分裂面の方向に影響を与える可能性があるかどうかを検討することにした。我々は、分裂組織の中心と新しい細胞壁の中心を結ぶ放射軸に対する鋭角として新しい細胞壁の向きを測定し（図 5e-i）、放射軸に対して 90° に近い角度で細胞が分裂する明確な傾向を観察し、70～80°（23.28%）と 80～90°（22.62%）で最も高い頻度が観察され（図 5e、i）、これは円周方向/横方向の細胞分裂に対応している（図 5h）。この細胞分裂挙動に対する GA シグナル伝達の寄与を調べるために、IPR と非 IPR の細胞分裂パラメータを別々に分析した（図 5i）。 IPR細胞における分裂角度分布は、非IPR細胞やSAM全体の細胞における分布とは異なり、IPR細胞では側方/円形細胞分裂の割合が高く、すなわち70～80°と80～90°（それぞれ33.86%と30.71%）であった（図5i）。したがって、我々の観察では、GAシグナル伝達活性と成長異方性との相関と同様に、高いGAシグナル伝達と円周方向に近い細胞分裂面の向きとの関連性が明らかになった（図5c、d）。この関連性の空間的保存性をさらに確立するために、P4から始まるこの領域で最も高いGAシグナル伝達活性が検出されたことから、P3から始まる原基周辺のIPR細胞における分裂面の向きを測定した（図4）。 P3とP4周辺のIPRの分裂角度には統計的に有意な差は見られなかったが、P4周辺のIPRでは側方細胞分裂の頻度が増加していることが観察された（図5j）。しかし、P5周辺のIPR細胞では、細胞分裂面の向きの違いが統計的に有意となり、横方向細胞分裂の頻度が急激に増加した（図5j）。これらの結果を総合すると、GAシグナル伝達はSAMにおける細胞分裂の向きを制御できることが示唆され、これは高レベルのGAシグナル伝達がIPRにおける細胞分裂の側方方向を誘導できるという以前の報告40,41と一致する。
IPR内の細胞は原基ではなく節間部に組み込まれると予測されている2,42,43。IPRにおける細胞分裂の横方向の配向は、節間部における表皮細胞の平行な縦方向の列という典型的な組織化をもたらす可能性がある。上記の観察結果は、GAシグナル伝達が細胞分裂の方向を制御することによってこのプロセスに役割を果たしている可能性が高いことを示唆している。
複数の DELLA 遺伝子の機能喪失により、構成的 GA 応答が生じ、della 変異体を用いてこの仮説を検証することができる 44。我々はまず、SAM における 5 つの DELLA 遺伝子の発現パターンを解析した。GUS ライン 45 の転写融合により、GAI、RGA、RGL1、および RGL2 (はるかに少ない程度) が SAM で発現していることが明らかになった (補足図 11a–d)。in situ ハイブリダイゼーションにより、GAI mRNA が原基および発達中の花に特異的に蓄積することがさらに実証された (補足図 11e)。RGL1 および RGL3 mRNA は SAM 全体および古い花で検出されたが、RGL2 mRNA は境界領域でより豊富であった (補足図 11f–h)。 pRGL3::RGL3-GFP SAMの共焦点イメージングにより、in situハイブリダイゼーションで観察された発現が確認され、RGL3タンパク質がSAMの中央部に蓄積することが示された（補足図11i）。pRGA::GFP-RGA系統を用いて、RGAタンパク質がSAMに蓄積することも確認したが、P4以降は境界部でその量が減少する（補足図11j）。注目すべきは、RGL3とRGAの発現パターンが、qmRGAで検出されたIPRにおける高いGAシグナル活性と一致していることである（図4）。さらに、これらのデータは、すべてのDELLAがSAMで発現しており、それらの発現が集合的にSAM全体に及んでいることを示している。
次に、野生型SAM（Ler、コントロール）とgai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della 5重変異体（グローバル）の細胞分裂パラメーターを分析した（図6a、b）。興味深いことに、della グローバル変異体SAMでは、野生型と比較して細胞分裂角度頻度の分布に統計的に有意な変化が見られた（図6c）。della グローバル変異体におけるこの変化は、80～90°の角度の頻度の増加（34.71% vs. 24.55%）と、程度は低いものの70～80°の角度の頻度の増加（23.78% vs. 20.18%）によるものであり、これは横方向の細胞分裂に対応する（図6c）。 della グローバル変異体では、非横断分裂 (0–60°) の頻度も低かった (図 6c)。della グローバル変異体の SAM では、横断細胞分裂の頻度が有意に増加した (図 6b)。IPR における横断細胞分裂の頻度も、野生型と比較して della グローバル変異体で高かった (図 6d)。IPR 領域外では、野生型では細胞分裂角度の分布がより均一であったのに対し、della グローバル変異体は IPR のように接線方向の分裂を好んだ (図 6e)。また、GA が蓄積する GA 不活性変異体背景である ga2 オキシダーゼ (ga2ox) 五重変異体 (ga2ox1-1、ga2ox2-1、ga2ox3-1、ga2ox4-1、ga2ox6-2) の SAM における細胞分裂の方向も定量化した。 GA レベルの上昇と一致して、5 重 ga2ox 変異体花序の SAM は Col-0 よりも大きく (補足図 12a、b)、Col-0 と比較して、5 重 ga2ox SAM は細胞分裂角度の分布が明らかに異なり、角度頻度が 50° から 90° に増加し、再び接線方向の分裂が優勢になった (補足図 12a–c)。したがって、GA シグナル伝達の構成的活性化と GA 蓄積が IPR と残りの SAM で側方細胞分裂を誘導することを示す。
a、b 共焦点顕微鏡を用いた、PI染色したLer（a）およびglobal della変異体（b）SAMのL1層の3D可視化。10時間かけてSAM（原基ではない）に形成された新しい細胞壁が示され、角度の値に応じて色分けされている。挿入図は0時間のSAMを示す。カラーバーは右下隅に表示される。（b）の矢印はglobal della変異体における整列した細胞列の例を指している。同様の結果が得られたため、実験は2回繰り返された。ce Lerとglobal dellaの間で、SAM全体（d）、IPR（e）、および非IPR（f）における細胞分裂面の向きの頻度分布を比較した。P値は両側コルモゴロフ・スミルノフ検定を用いて得られた。 f、g Col-0 (i) および pCUC2::gai-1-VENUS (j) 形質転換植物の PI 染色 SAM の共焦点画像の 3D 可視化。パネル (a、b) は、10 時間以内に SAM に形成された新しい細胞壁 (原基ではない) を示しています。実験は同様の結果で 2 回繰り返されました。h–j Col-0 植物と pCUC2::gai-1-VENUS 植物の間で、SAM 全体 (h)、IPR (i) および非 IPR (j) に位置する細胞分裂面の方向の頻度分布の比較。P 値は、両側 Kolmogorov–Smirnov 検定を使用して取得しました。
次に、IPR で特異的に GA シグナル伝達を阻害した場合の効果をテストしました。この目的のために、子葉カップ 2 (CUC2) プロモーターを使用して、VENUS に融合した優性阻害型 gai-1 タンパク質の発現を駆動しました (pCUC2::gai-1-VENUS 系統)。野生型 SAM では、CUC2 プロモーターは、境界細胞を含む SAM のほとんどの IPR の発現を P4 以降駆動し、同様の特異的発現が pCUC2::gai-1-VENUS 植物でも観察されました (下記参照)。pCUC2::gai-1-VENUS 植物の SAM または IPR 全体にわたる細胞分裂角度の分布は、野生型と有意な差はありませんでしたが、予想外にも、これらの植物の IPR を持たない細胞は 80～90° という高い頻度で分裂していることがわかりました (図 6f～j)。
細胞分裂の方向はSAMの形状、特に組織の湾曲によって生じる引張応力に依存することが示唆されている46。そこで我々は、dellaグローバル変異体とpCUC2::gai-1-VENUS植物でSAMの形状が変化しているかどうかを調べた。以前に報告したように12、dellaグローバル変異体のSAMのサイズは野生型よりも大きかった（補足図13a、b、d）。CLV3とSTM RNAのin situハイブリダイゼーションにより、della変異体における分裂組織の拡大が確認され、さらに幹細胞ニッチの側方拡大が示された（補足図13e、f、h、i）。しかし、SAMの湾曲は両方の遺伝子型で類似していた（補足図13k、m、n、p）。野生型と比較して、曲率の変化なしに gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della 四重変異体でも同様のサイズの増大が観察された（補足図 13c、d、g、j、l、o、p）。細胞分裂方向の頻度も della 四重変異体で影響を受けたが、della 単一変異体よりも程度は小さかった（補足図 12d–f）。この用量効果と曲率への影響がないことから、Della 四重変異体における残存 RGL3 活性が DELLA 活性の喪失によって引き起こされる細胞分裂方向の変化を制限し、側方細胞分裂の変化は SAM の形状の変化ではなく GA シグナル伝達活性の変化に応じて起こることが示唆される。前述のように、CUC2プロモーターはP4からSAMにおけるIPRの発現を誘導し（補足図14a、b）、対照的にpCUC2::gai-1-VENUS SAMはサイズが小さく、曲率が高かった（補足図14c～h）。このpCUC2::gai-1-VENUS SAMの形態変化は、野生型と比較して機械的ストレスの分布が異なり、高い周方向ストレスがSAM中心からより短い距離で発生する可能性がある47。あるいは、pCUC2::gai-1-VENUS SAMの形態変化は、トランスジーンの発現によって誘発される局所的な機械的特性の変化に起因する可能性がある48。どちらの場合も、これは細胞が周方向/横方向の方向に分裂する可能性を高めることでGAシグナル伝達の変化の影響を部分的に相殺し、我々の観察結果を説明できる可能性がある。
総合すると、我々のデータは、高いGAシグナル伝達がIPRにおける細胞分裂面の横方向の配向に積極的な役割を果たしていることを裏付けている。また、分裂組織の湾曲もIPRにおける細胞分裂面の配向に影響を与えることを示している。
GAシグナル伝達活性が高いため、IPRにおける分裂面の横方向の配向は、GAがSAM内の表皮に放射状の細胞列を事前に組織化し、後に表皮節間に見られる細胞組織を規定することを示唆している。実際、このような細胞列は、della global変異体のSAM画像で頻繁に観察された（図6b）。そこで、SAMにおけるGAシグナル伝達の空間パターンの発生機能をさらに探るため、タイムラプスイメージングを用いて、野生型（LerおよびCol-0）、della global変異体、およびpCUC2::gai-1-VENUSトランスジェニック植物のIPRにおける細胞の空間組織を解析した。
qmRGA では、IPR における GA シグナル活性が P1/P2 から増加し、P4 でピークに達し、このパターンが時間とともに一定に保たれていることがわかった (図 4a–f および補足図 8c–f、k)。 GA シグナルの増加に伴う IPR における細胞の空間的組織を分析するために、最初の観察から 34 時間後、つまり 2 倍加時間以上経過した時点で分析した発生運命に従って、P4 の上と側面の Ler IPR 細胞を標識し、P1/P2 から P4 までの原基発生中の IPR 細胞を追跡できるようにした。 3 つの異なる色を使用した。P4 付近の原基に組み込まれた細胞には黄色、IPR にある細胞には緑色、両方のプロセスに関与した細胞には紫色 (図 7a–c)。 t0 (0 時間) では、P4 の前に 1–2 層の IPR 細胞が見られた (図 7a)。予想通り、これらの細胞が分裂したとき、主に横断分裂面を介して分裂した（図7a～c）。Col-0 SAM（LerのP4と同様に境界が折り畳まれるP3に焦点を当てた）を使用した場合も同様の結果が得られたが、この遺伝子型では花縁に形成された折り畳みによってIPR細胞がより早く隠された（図7g～i）。したがって、IPR細胞の分裂パターンは、節間と同様に、細胞を放射状の列に事前に組織化する。放射状の列の組織化と、連続する器官間のIPR細胞の局在は、これらの細胞が節間前駆細胞であることを示唆している。
本研究では、GAとGA受容体の濃度の組み合わせによって生じるGAシグナル伝達活性を定量的にマッピングできるレシオメトリックGAシグナル伝達バイオセンサーqmRGAを開発しました。これにより、内因性シグナル伝達経路への干渉を最小限に抑え、細胞レベルでのGA機能に関する情報を得ることができます。この目的のために、DELLA相互作用パートナーに結合する能力を失ったものの、GA誘導性タンパク質分解に対して感受性を維持する改変DELLAタンパク質mRGAを構築しました。qmRGAは、GAレベルの外因性および内因性の変化の両方に反応し、その動的なセンシング特性により、発生中のGAシグナル伝達活性の時空間的変化を評価できます。qmRGAは、発現に使用するプロモーターを変更することで（必要に応じて）さまざまな組織に適応できるため、非常に柔軟なツールでもあります。また、GAシグナル伝達経路とPFYREモチーフは被子植物全体で保存されているため、他の種にも応用できる可能性が高いと考えられます22。これと一致して、イネSLR1 DELLAタンパク質の同等の変異（HYY497AAA）も、mRGA23と同様に、SLR1の成長抑制活性を抑制しつつ、GAを介した分解をわずかに減少させることが示された。注目すべきことに、シロイヌナズナの最近の研究では、PFYREドメインの単一アミノ酸変異（S474L）が、転写因子パートナーとの相互作用能力に影響を与えることなく、RGAの転写活性を変化させたことが示されている50。この変異はmRGAに存在する3つのアミノ酸置換に非常に近いが、我々の研究では、これら2つの変異がDELLAの異なる特性を変化させることが示されている。ほとんどの転写因子パートナーはDELLAのLHR1およびSAWドメインに結合するが26,51、PFYREドメインのいくつかの保存アミノ酸がこれらの相互作用を安定化させるのに役立つ可能性がある。
節間発達は植物の形態と収量向上における重要な形質です。qmRGAにより、IPR節間前駆細胞でGAシグナル伝達活性が高いことが明らかになりました。定量イメージングと遺伝学を組み合わせることで、GAシグナル伝達パターンがSAM表皮の円形/横断的な細胞分裂面に重なり、節間発達に必要な細胞分裂組織を形成することを示しました。発生中に細胞分裂面の方向を制御するいくつかの因子が特定されています52,53。私たちの研究は、GAシグナル伝達活性がこの細胞パラメーターをどのように制御するかの明確な例を提供します。DELLAはプレフォールディングタンパク質複合体と相互作用できるため41、GAシグナル伝達は皮質微小管の方向に直接影響を与えることで細胞分裂面の方向を制御する可能性があります40,41,54,55。SAMでは、GAシグナル伝達活性が高いことの相関関係は細胞の伸長や分裂ではなく、成長異方性のみであることが予想外に示されました。これは、IPRにおける細胞分裂の方向に対するGAの直接的な影響と一致しています。しかし、この効果が間接的である可能性も否定できません。例えば、GA誘導性の細胞壁軟化56を介して間接的に生じる可能性もあります。細胞壁の特性の変化は機械的ストレスを誘発し57,58、これは皮質微小管の配向に影響を与えることで細胞分裂面の配向にも影響を与える可能性があります39,46,59。GA誘導性の機械的ストレスとGAによる微小管配向の直接的な制御の複合効果が、節間を定義するIPRにおける細胞分裂配向の特定のパターンの生成に関与している可能性があり、この考えを検証するにはさらなる研究が必要です。同様に、これまでの研究では、節間形成の制御におけるDELLA相互作用タンパク質TCP14および15の重要性が強調されており60,61、これらの因子は、節間発達を制御し、GAシグナル伝達に影響を与えることが示されているBREVIPEDICELLUS（BP）およびPENNYWISE（PNY）とともにGAの作用を媒介する可能性があります2,62。 DELLA細胞はブラシノステロイド、エチレン、ジャスモン酸、アブシジン酸（ABA）シグナル伝達経路と相互作用し63,64、これらのホルモンは微小管の配向に影響を与えることができる65ことから、GAの細胞分裂方向への影響は他のホルモンによっても媒介される可能性がある。
初期の細胞学的研究では、シロイヌナズナのSAMの内側領域と外側領域の両方が節間発達に必要であることが示されました2,42。GAが内側組織の細胞分裂を積極的に制御しているという事実12は、SAMにおける分裂組織と節間サイズの制御におけるGAの二重機能を裏付けています。方向性のある細胞分裂のパターンも内側SAM組織で厳密に制御されており、この制御は茎の成長に不可欠です52。GAが内側SAM組織における細胞分裂面の方向付けにも役割を果たし、それによってSAM内の節間の特定と発達を同期させているかどうかを調べることは興味深いでしょう。
植物は、標準条件（16 時間光照射、22 °C）下で、土壌または 1% スクロースと 1% アガー（Sigma）を添加した 1x ムラシゲ・スクーグ（MS）培地（Duchefa）で試験管内で栽培した。ただし、胚軸と根の成長実験では、実生は垂直プレート上で定常光と 22 °C 下で栽培した。硝酸塩実験では、植物は適切な硝酸塩（0 または 10 mM KNO3）、0.5 mM NH4-コハク酸、1% スクロース、1% A-アガー（Sigma）を添加した改変 MS 培地（bioWORLD 植物培地）で長日条件下で栽培した。
pDONR221に挿入されたGID1a cDNAをpDONR P4-P1R-pUBQ10およびpDONR P2R-P3-mCherryと組み換え、pB7m34GWを作製してpUBQ10::GID1a-mCherryを生成した。pDONR221に挿入されたIDD2 DNAを組み換え、pB7RWG266を作製してp35S:IDD2-RFPを生成した。 pGID1b::2xmTQ2-GID1bを生成するために、まず、補足表3のプライマーを使用して、GID1bコード領域の上流にある3.9 kbの断片と、GID1b cDNA（1.3 kb）とターミネーター（3.4 kb）を含む4.7 kbの断片を増幅し、それぞれpDONR P4-P1R（Thermo Fisher Scientific）とpDONR P2R-P3（Thermo Fisher Scientific）に挿入し、最後にGatewayクローニングを使用してpDONR221 2xmTQ268と組み換えてpGreen 012567ターゲットベクターに組み込みました。 pCUC2::LSSmOrangeを生成するために、CUC2プロモーター配列（ATGの上流3229 bp）に続いて、N7核局在シグナルとNOS転写終結因子を持つ大型ストークスシフトmOrange（LSSmOrange）69のコード配列を、Gateway 3フラグメント組換えシステム（Invitrogen）を使用してpGreenカナマイシン標的ベクターに組み込んだ。植物バイナリーベクターは、それぞれアグロバクテリウム浸潤法によりAgrobacterium tumefaciens株GV3101に導入され、Nicotiana benthamianaの葉に導入され、花浸漬法によりArabidopsis thaliana Col-0に導入された。pUBQ10::qmRGA、pUBQ10::GID1a-mCherry、pCLV3::mCherry-NLS qmRGAは、それぞれそれぞれの交配のF3およびF1子孫から単離された。
RNA in situ ハイブリダイゼーションは、採取後すぐに4℃に予冷したFAA溶液（3.7%ホルムアルデヒド、5%酢酸、50%エタノール）で固定した長さ約1cmのシュート先端72に対して実施した。15分間の真空処理を2回行った後、固定液を交換し、サンプルを一晩インキュベートした。GID1a、GID1b、GID1c、GAI、RGL1、RGL2、およびRGL3 cDNAと、それらの3'-UTRに対するアンチセンスプローブは、Rosierら73によって記載されたように、補足表3に示すプライマーを使用して合成した。ジゴキシゲニン標識プローブは、ジゴキシゲニン抗体（3000倍希釈；ロシュ、カタログ番号：11 093 274 910）を用いて免疫検出され、切片は5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸（BCIP、250倍希釈）/ニトロブルーテトラゾリウム（NBT、200倍希釈）溶液で染色された。
投稿日時：2025年2月10日
