この研究では、植物成長調整剤2,4-Dおよびカイネチンと酸化鉄ナノ粒子（Fe₃O₄-NPs）が、*Hypericum perforatum* L.におけるin vitro形態形成および二次代謝産物産生に及ぼす影響について調査した。最適化された処理（2,4-D（0.5 mg/L）+カイネチン（2 mg/L）+ Fe₃O₄-NPs（4 mg/L））は、対照群と比較して、植物の生育パラメータを著しく改善した。草丈は59.6%、根長は114.0%、芽数は180.0%、カルス生重量は198.3%増加した。この併用処理は、再生効率（50.85%）の向上とヒペリシン含有量の66.6%増加も示した。 GC-MS分析の結果、ヒペロシド、β-パトレン、セチルアルコールの含有量が高く、総ピーク面積の93.36%を占めていることが明らかになりました。また、フェノール類とフラボノイド類の含有量は最大80.1%増加しました。これらの結果は、植物成長調整剤（PGR）とFe₃O₄ナノ粒子（Fe₃O₄-NP）が器官形成と生理活性化合物の蓄積を促進することで相乗効果を発揮することを示しており、薬用植物のバイオテクノロジー的改良に向けた有望な戦略となります。
セントジョーンズワート（学名：Hypericum perforatum L.）は、オトギリソウ科の多年生草本植物で、経済的価値があります。[1] 潜在的な生物活性成分には、天然タンニン、キサントン、フロログルシノール、ナフタレンジアントロン（ヒペリンおよびプソイドヒペリン）、フラボノイド、フェノール酸、エッセンシャルオイルなどがあります。[2,3,4] セントジョーンズワートは伝統的な方法で繁殖させることができますが、伝統的な方法の季節性、種子の発芽率の低さ、病気への感受性により、大規模栽培と二次代謝物の継続的な生成の可能性は制限されます。[1,5,6]
このように、in vitro組織培養は、植物の急速な増殖、遺伝資源の保全、そして医薬化合物の収量増加に効果的な方法と考えられています[7, 8]。植物成長調整剤（PGR）は形態形成の制御において重要な役割を果たし、カルスや個体のin vitro培養に不可欠です。これらの発育プロセスを成功させるには、PGRの濃度と組み合わせを最適化することが不可欠です[9]。したがって、セントジョーンズワート（H. perforatum）の成長と再生能力を向上させるには、適切な調整剤の組成と濃度を理解することが重要です[10]。
酸化鉄ナノ粒子（Fe₃O₄）は、組織培養用に開発されている、あるいは現在開発中のナノ粒子の一種です。Fe₃O₄は優れた磁性、良好な生体適合性、そして植物の成長促進と環境ストレス軽減の能力を有するため、組織培養設計において大きな注目を集めています。これらのナノ粒子の潜在的な用途としては、細胞分裂の促進、栄養吸収の改善、抗酸化酵素の活性化といったin vitro培養の最適化などが挙げられます[11]。
ナノ粒子は植物の成長に優れた促進効果を示しているものの、*H. perforatum*におけるFe₃O₄ナノ粒子と最適化された植物成長調整剤の併用に関する研究は依然として不足しています。この知識ギャップを埋めるため、本研究では、in vitroでの形態形成および二次代謝産物の生産に対するそれらの併用効果を評価し、薬用植物の特性改善のための新たな知見を提供します。したがって、本研究には2つの目的があります。(1) in vitroでカルス形成、シュート再生および発根を効果的に促進するために植物成長調整剤の濃度を最適化すること、および(2) in vitroでFe₃O₄ナノ粒子が成長パラメータに及ぼす影響を評価することです。今後の計画には、順応過程（in vitro）での再生植物の生存率を評価することが含まれます。本研究の結果は、*H. perforatum*の微細増殖効率を大幅に向上させ、それによってこの重要な薬用植物の持続可能な利用とバイオテクノロジーへの応用に貢献することが期待されます。
本研究では、圃場で生育したセントジョーンズワートの一年生植物（母植物）から葉片を採取した。これらの葉片を用いて、in vitro培養条件を最適化した。培養前に、葉を蒸留水で数分間十分に洗浄した。次に、葉片表面を70%エタノールに30秒間浸漬し、続いてTween 20を数滴加えた1.5%次亜塩素酸ナトリウム（NaOCl）溶液に10分間浸漬して消毒した。最後に、葉片を滅菌蒸留水で3回洗浄した後、次の培養培地に移した。
その後4週間にわたり、再生率、組織片あたりのシュート数、シュート長などのシュート再生パラメータを測定した。再生したシュートが2cm以上の長さに達した時点で、MS培地の半分の濃度、0.5 mg/Lインドール酪酸（IBA）、および0.3%グアーガムを含む発根培地に移植した。発根培養は3週間継続され、その間に発根率、根数、根長が測定された。各処理は3回繰り返し、1回につき10個の組織片を培養し、処理ごとに約30個の組織片を得た。
植物の高さは、定規を用いて、植物の根元から最も高い葉の先端までセンチメートル（cm）単位で測定しました。根の長さは、苗木を慎重に摘み取り、培地を取り除いた直後にミリメートル（mm）単位で測定しました。組織片あたりの芽の数は、各植物上で直接数えました。葉の黒い斑点（結節）の数は目視で測定しました。これらの黒い結節は、ヒペリシンを含む腺、または酸化斑であると考えられており、植物の処理に対する反応の生理学的指標として用いられています。培地をすべて取り除いた後、苗木の生重量をミリグラム（mg）単位の精度を持つ電子秤を用いて測定しました。
カルス形成率の算出方法は以下の通りである。各種成長調節因子（キナーゼ、2,4-D、Fe3O4）を含む培地で組織片を4週間培養した後、カルスを形成可能な組織片の数を数える。カルス形成率の算出式は以下のとおりである。
各処理は 3 回繰り返され、各繰り返しごとに少なくとも 10 個の組織片が検査されました。
再生率は、カルス形成段階後に芽分化過程を正常に完了したカルス組織の割合を反映しています。この指標は、カルス組織が分化組織へと変化し、新たな植物器官へと成長する能力を示しています。
発根係数とは、発根可能な枝の数と総枝数の比率です。この指標は発根段階の成功度を反映しており、マイクロプロパゲーションや植物の繁殖において非常に重要です。良好な発根は、生育条件下での苗木の生存率向上に大きく貢献します。
ヒペリシン化合物は90%メタノールで抽出した。乾燥植物材料50mgをメタノール1mlに加え、超音波洗浄機（モデルA5120-3YJ）を用いて、室温、暗所で30kHz、20分間超音波処理した。超音波処理後、サンプルを6000rpmで15分間遠心分離した。上清を回収し、Conceiçaoら[14]の方法に従い、Plus-3000S分光光度計を用いて592nmにおけるヒペリシンの吸光度を測定した。
植物成長調整剤（PGR）と酸化鉄ナノ粒子（Fe₃O₄-NP）を用いた処理のほとんどでは、再生したシュート葉に黒色根粒の形成は誘導されませんでした。0.5 または 1 mg/L 2,4-D、0.5 または 1 mg/L カイネチン、1、2、または 4 mg/L の酸化鉄ナノ粒子を用いたいずれの処理でも、根粒は観察されませんでした。2,4-D（0.5～2 mg/L）とカイネチン（1～1.5 mg/L）および酸化鉄ナノ粒子（2～4 mg/L）の組み合わせなど、カイネチンや酸化鉄ナノ粒子の濃度が高い場合、いくつかの組み合わせでは根粒の発達がわずかに増加しました（ただし、統計的に有意ではありません）。これらの結果を図 2 に示します。黒色根粒は、自然に発生する有益なヒペリシンを豊富に含む腺を表しています。この研究では、黒色結節は主に組織の褐色化と関連しており、ヒペリシンの蓄積に好ましい環境であることを示している。2,4-D、カイネチン、Fe₃O₄ナノ粒子の処理により、カルスの成長が促進され、褐色化が減少し、クロロフィル含有量が増加したことから、代謝機能の改善と酸化ダメージの潜在的な減少が示唆されている[37]。この研究では、2,4-DおよびFe₃O₄ナノ粒子と組み合わせたカイネチンの、セントジョーンズワートカルスの成長と発達に対する効果を評価した（図3a–g）。以前の研究で、Fe₃O₄ナノ粒子には抗真菌作用と抗菌作用があり[38, 39]、植物成長調整剤と組み合わせて使用すると、植物の防御機構を刺激し、細胞ストレス指数を低下させることができることが示されている[18]。二次代謝物の生合成は遺伝的に制御されているが、実際の収量は環境条件に大きく依存している。代謝および形態学的変化は、特定の植物遺伝子の発現を制御し、環境因子に反応することで、二次代謝産物のレベルに影響を与える可能性があります。さらに、誘導物質は新たな遺伝子の活性化を引き起こし、それが酵素活性を刺激し、最終的に複数の生合成経路を活性化して二次代謝産物の形成につながります。さらに、別の研究では、遮光を減らすことで日光曝露量が増加し、*Hypericum perforatum*の自然生息地における日中の気温が上昇し、ヒペリシンの収量増加にも寄与することが示されています。これらのデータに基づき、本研究では、組織培養における鉄ナノ粒子の潜在的な誘導物質としての役割を調査しました。その結果、これらのナノ粒子は酵素刺激を介してヘスペリジン生合成に関与する遺伝子を活性化し、この化合物の蓄積を増加させることが示されました（図2）。したがって、自然条件下で生育する植物と比較して、適度なストレスと二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子の活性化を組み合わせることで、生体内でのこれらの化合物の生産も促進されると考えられます。併用療法は一般に再生率にプラスの効果をもたらしますが、場合によってはこの効果が弱まります。特に、1 mg/L 2,4-D、1.5 mg/L キナーゼ、およびさまざまな濃度での処理は、対照群と比較して、再生率を独立して 50.85% 大幅に増加させることができました (図 4c)。これらの結果は、ナノホルモンの特定の組み合わせが相乗的に作用して植物の成長と代謝産物の産生を促進できることを示唆しており、これは薬用植物の組織培養にとって非常に重要です。Palmer と Keller [50] は、2,4-D 処理は St. perforatum で独立してカルス形成を誘導し、キナーゼの添加はカルス形成と再生を大幅に促進することを示しました。この効果は、ホルモンバランスの改善と細胞分裂の刺激によるものでした。Bal ら [51] Fe₃O₄ナノ粒子を0.5 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/Lの濃度で含む培地は、亜麻植物の再生率を向上させた[52]。カイネチン、2,4-ジクロロベンゾチアゾリノン、およびFe₃O₄ナノ粒子の使用は、カルスおよび根の形成率を著しく向上させたが、これらのホルモンをin vitro再生に使用する場合の潜在的な副作用を考慮する必要がある。例えば、2,4-ジクロロベンゾチアゾリノンまたはカイネチンを長期または高濃度で使用すると、体細胞クローン変異、酸化ストレス、カルス形態異常、またはガラス化が生じる可能性がある。したがって、高い再生率は必ずしも遺伝的安定性を予測するものではない。再生された植物はすべて、分子マーカー（RAPD、ISSR、AFLPなど）または細胞遺伝学的分析を使用して評価し、生体内植物との均質性と類似性を判断する必要があります[53,54,55]。
本研究では、植物成長調整剤（2,4-Dおよびカイネチン）とFe₃O₄ナノ粒子の併用が、*Hypericum perforatum*における形態形成と主要な生理活性代謝物（ヒペリシンおよびヒペロシドを含む）の蓄積を促進できることを初めて実証しました。最適化された処理レジメン（1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L カイネチン + 4 mg/L Fe₃O₄-NP）は、カルス形成、器官形成、および二次代謝物の収量を最大化しただけでなく、軽度の誘導効果も示し、植物のストレス耐性と薬効価値を向上させる可能性を示しました。ナノテクノロジーと植物組織培養の組み合わせは、医薬化合物の大規模in vitro生産のための持続可能かつ効率的なプラットフォームを提供します。これらの結果は、産業応用への道を開き、分子メカニズム、投与量の最適化、遺伝的精度に関する将来の研究に道を開き、薬用植物に関する基礎研究と実用的なバイオテクノロジーを結び付けます。
投稿日時: 2025年12月12日