この研究では、植物成長調節剤セイヨウオトギリソウ（Hypericum perforatum L.）のin vitro形態形成と二次代謝産物生産に対する、2,4-Dとキネチン、および酸化鉄ナノ粒子（Fe₃O₄-NPs）の影響を調査した。最適化された処理[2,4-D（0.5 mg/L）+キネチン（2 mg/L）+Fe₃O₄-NPs（4 mg/L）]は、対照群と比較して、植物の成長パラメータを大幅に改善した。植物の高さは59.6%、根の長さは114.0%、芽の数は180.0%、カルスの生重量は198.3%増加した。この複合処理は、再生効率（50.85%）も向上させ、ヒペリシン含有量を66.6%増加させた。 GC-MS分析により、ハイペロシド、β-パトレン、セチルアルコールの含有量が高く、全ピーク面積の93.36%を占めていることが明らかになった一方、総フェノール類とフラボノイドの含有量は80.1%も増加した。これらの結果は、植物成長調節剤（PGR）とFe₃O₄ナノ粒子（Fe₃O₄-NPs）が器官形成と生物活性化合物の蓄積を刺激することで相乗効果を発揮し、薬用植物のバイオテクノロジーによる改良に向けた有望な戦略となることを示している。
セントジョーンズワート（学名：Hypericum perforatum L.）は、オトギリソウ科の多年生草本植物で、経済的価値があります。[1] 潜在的な生物活性成分には、天然タンニン、キサントン、フロログルシノール、ナフタレンジアントロン（ハイペリンおよびプソイドハイペリン）、フラボノイド、フェノール酸、精油などがあります。[2,3,4] セントジョーンズワートは伝統的な方法で繁殖できますが、伝統的な方法の季節性、種子の発芽率の低さ、病気への感受性により、大規模栽培や二次代謝産物の継続的な生成の可能性が制限されています。[1,5,6]
したがって、試験管内組織培養は、植物の迅速な増殖、遺伝資源の保存、および薬用化合物の収量増加に効果的な方法と考えられています[7, 8]。植物成長調節物質（PGR）は形態形成の調節に重要な役割を果たし、カルスおよび全生物の試験管内培養に必要です。これらの発生プロセスを成功裏に完了するには、その濃度と組み合わせの最適化が不可欠です[9]。したがって、調節物質の適切な組成と濃度を理解することは、セイヨウオトギリソウ（H. perforatum）の成長と再生能力を向上させるために重要です[10]。
酸化鉄ナノ粒子（Fe₃O₄）は、組織培養用に開発されてきた、または開発中のナノ粒子の一種です。Fe₃O₄は、優れた磁気特性、良好な生体適合性、植物の成長促進および環境ストレス軽減能力を有するため、組織培養設計において大きな注目を集めています。これらのナノ粒子の潜在的な用途には、細胞分裂を促進し、栄養素の吸収を改善し、抗酸化酵素を活性化するためのin vitro培養の最適化が含まれる可能性があります[11]。
ナノ粒子は植物の成長促進に優れた効果を示すことが知られていますが、セイヨウオトギリソウ（H. perforatum）におけるFe₃O₄ナノ粒子と最適化された植物成長調節剤の併用に関する研究は依然として少ないのが現状です。この知識のギャップを埋めるため、本研究では、これらの併用効果がin vitroでの形態形成と二次代謝産物の生産に及ぼす影響を評価し、薬用植物の特性改善のための新たな知見を提供することを目的としました。したがって、本研究の目的は以下の2点です。（1）植物成長調節剤の濃度を最適化し、in vitroでのカルス形成、シュート再生、発根を効果的に促進すること、（2）in vitroでの成長パラメータに対するFe₃O₄ナノ粒子の影響を評価すること。今後の計画としては、in vitroでの順化中の再生植物の生存率を評価する予定です。本研究の結果は、セイヨウオトギリソウのマイクロプロパゲーション効率を大幅に向上させ、この重要な薬用植物の持続可能な利用とバイオテクノロジー応用に貢献することが期待されます。
本研究では、野外で栽培した一年生セイヨウオトギリソウ（母植物）から葉の組織片を採取した。これらの組織片を用いて、試験管内培養条件を最適化した。培養前に、葉を数分間流水で十分に洗浄した。次に、組織片の表面を70%エタノールに30秒間浸漬して消毒し、続いてTween 20を数滴加えた1.5%次亜塩素酸ナトリウム（NaOCl）溶液に10分間浸漬した。最後に、組織片を滅菌蒸留水で3回すすぎ、次の培養培地に移した。
続く4週間、シュート再生率、外植片あたりのシュート数、シュート長などのシュート再生パラメータを測定した。再生したシュートが少なくとも2cmの長さに達したら、半濃度MS培地、0.5mg/Lインドール酪酸（IBA）、および0.3%グアーガムからなる発根培地に移した。発根培養は3週間続け、その間、発根率、根数、および根長を測定した。各処理は3回繰り返し、1回の反復につき10個の外植片を培養し、1処理あたり約30個の外植片を得た。
植物の高さは、定規を使って植物の基部から最も高い葉の先端までをセンチメートル（cm）で測定した。根の長さは、苗を慎重に取り除き、培地を取り除いた直後にミリメートル（mm）で測定した。外植片あたりの芽の数は、各植物で直接数えた。葉にある黒い斑点（結節と呼ばれる）の数は目視で測定した。これらの黒い結節は、ヒペリシンを含む腺、または酸化斑と考えられており、植物の処理に対する反応の生理学的指標として使用される。培地をすべて取り除いた後、苗の生重量をミリグラム（mg）単位の精度を持つ電子秤で測定した。
カルス形成率の算出方法は以下のとおりです。各種成長調節物質（キナーゼ、2,4-D、Fe3O4）を含む培地で外植片を4週間培養した後、カルスを形成可能な外植片の数を数えます。カルス形成率の算出式は以下のとおりです。
各処置は3回繰り返され、各反復において少なくとも10個の組織片が検査された。
再生率は、カルス形成段階後、芽分化過程を正常に完了したカルス組織の割合を示します。この指標は、カルス組織が分化組織へと変化し、新たな植物器官へと成長する能力を表しています。
発根係数とは、発根可能な枝の数と全枝数の比率です。この指標は発根段階の成功度合いを示しており、組織培養や植物繁殖において非常に重要です。発根が良好であれば、苗が生育環境でよりよく生き残ることができるからです。
ヒペリシン化合物は90%メタノールで抽出した。乾燥植物材料50mgをメタノール1mlに加え、室温、暗所で超音波洗浄器（モデルA5120-3YJ）を用いて30kHzで20分間超音波処理した。超音波処理後、サンプルを6000rpmで15分間遠心分離した。上清を回収し、Conceiçaoら[14]の方法に従ってPlus-3000 S分光光度計を用いて592nmにおけるヒペリシンの吸光度を測定した。
植物成長調節剤（PGR）および酸化鉄ナノ粒子（Fe₃O₄-NP）によるほとんどの処理では、再生したシュートの葉に黒色の結節形成は誘発されなかった。0.5または1 mg/Lの2,4-D、0.5または1 mg/Lのキネチン、または1、2、4 mg/Lの酸化鉄ナノ粒子による処理では、結節は観察されなかった。いくつかの組み合わせでは、キネチンおよび/または酸化鉄ナノ粒子の濃度が高い場合に結節の発達がわずかに増加したが（統計的に有意ではなかった）、例えば2,4-D（0.5～2 mg/L）とキネチン（1～1.5 mg/L）および酸化鉄ナノ粒子（2～4 mg/L）の組み合わせなどであった。これらの結果を図2に示す。黒色の結節は、ヒペリシンを豊富に含む腺を表し、自然発生的で有益なものである。この研究では、黒色の結節は主に組織の褐変と関連しており、ヒペリシン蓄積に好ましい環境を示している。2,4-D、キネチン、およびFe₃O₄ナノ粒子による処理は、カルスの成長を促進し、褐変を減少させ、クロロフィル含有量を増加させ、代謝機能の改善と酸化損傷の潜在的な減少を示唆している[37]。この研究では、2,4-DおよびFe₃O₄ナノ粒子と組み合わせたキネチンがセントジョーンズワートカルスの成長と発達に及ぼす影響を評価した（図3a～g）。これまでの研究では、Fe₃O₄ナノ粒子は抗真菌活性および抗菌活性を有し[38, 39]、植物成長調節剤と組み合わせて使用すると、植物の防御機構を刺激し、細胞ストレス指数を減少させることができることが示されている[18]。二次代謝産物の生合成は遺伝的に制御されているが、実際の収量は環境条件に大きく依存する。代謝的および形態的変化は、特定の植物遺伝子の発現を調節し、環境要因に反応することで、二次代謝産物のレベルに影響を与える可能性があります。さらに、誘導物質は新しい遺伝子の活性化を引き起こし、それが酵素活性を刺激し、最終的に複数の生合成経路を活性化して二次代謝産物の形成につながります。また、別の研究では、遮光を減らすと日光への曝露が増加し、それによってセイヨウオトギリソウの自然生息地の日中の気温が上昇し、ヒペリシン収量の増加にも寄与することが示されました。これらのデータに基づいて、本研究では組織培養における潜在的な誘導物質としての鉄ナノ粒子の役割を調査しました。その結果、これらのナノ粒子は酵素刺激を介してヘスペリジン生合成に関与する遺伝子を活性化し、この化合物の蓄積が増加することが示されました（図2）。したがって、自然条件下で生育する植物と比較して、適度なストレスと二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子の活性化を組み合わせると、生体内でのこのような化合物の生産も促進されると考えられます。複合処理は一般的に再生率にプラスの効果をもたらしますが、場合によってはこの効果が弱まります。特に、1 mg/L 2,4-D、1.5 mg/L キナーゼ、および異なる濃度での処理は、対照群と比較して再生率を 50.85% 独立して有意に増加させることができました (図 4c)。これらの結果は、ナノホルモンの特定の組み合わせが相乗的に作用して植物の成長と代謝産物の生成を促進することができることを示唆しており、これは薬用植物の組織培養にとって非常に重要です。Palmer と Keller [50] は、2,4-D 処理が単独で St. perforatum のカルス形成を誘導できることを示し、キナーゼの添加はカルス形成と再生を著しく強化しました。この効果は、ホルモンバランスの改善と細胞分裂の刺激によるものでした。Bal ら [51] は、Fe₃O₄-NP 処理が単独で抗酸化酵素の機能を強化し、それによって St. perforatum の根の成長を促進することを発見しました。 0.5 mg/L、1 mg/L、および 1.5 mg/L の濃度で Fe₃O₄ ナノ粒子を含む培養培地は、アマ植物の再生率を向上させた [52]。キネチン、2,4-ジクロロベンゾチアゾリノン、および Fe₃O₄ ナノ粒子の使用は、カルスおよび根の形成率を大幅に向上させたが、これらのホルモンを in vitro 再生に使用する場合の潜在的な副作用を考慮する必要がある。たとえば、2,4-ジクロロベンゾチアゾリノンまたはキネチンの長期または高濃度の使用は、体細胞クローン変異、酸化ストレス、異常なカルス形態、またはガラス化を引き起こす可能性がある。したがって、高い再生率は必ずしも遺伝的安定性を予測するものではない。再生された植物はすべて、分子マーカー（RAPD、ISSR、AFLPなど）または細胞遺伝学的分析を使用して評価し、生体内の植物との均一性と類似性を判断する必要があります[53,54,55]。
本研究は、植物成長調節剤（2,4-Dおよびキネチン）とFe₃O₄ナノ粒子を併用することで、セイヨウオトギリソウ（Hypericum perforatum）の形態形成と主要な生理活性代謝物（ヒペリシンおよびハイペロシドを含む）の蓄積を促進できることを初めて実証した。最適化された処理レジメン（1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L キネチン + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs）は、カルス形成、器官形成、二次代謝産物収量を最大化するだけでなく、穏やかな誘導効果も示し、植物のストレス耐性と薬効の向上につながる可能性を示した。ナノテクノロジーと植物組織培養の組み合わせは、薬用化合物の大規模なin vitro生産のための持続可能で効率的なプラットフォームを提供する。これらの結果は、産業応用や、分子メカニズム、投与量の最適化、遺伝子精度に関する今後の研究への道を開き、薬用植物に関する基礎研究と実用的なバイオテクノロジーを結びつけるものである。
投稿日時：2025年12月12日
