駆虫薬N,N-ジエチル-m-トルアミド（ディート) は、AChE (アセチルコリンエステラーゼ) を阻害することが報告されており、過度の血管新生による潜在的な発癌性がある。本論文では、DEET が血管新生を促進する内皮細胞を特異的に刺激し、それによって腫瘍の増殖を増加させることを示す。DEET は、増殖、遊走、接着など、血管新生につながる細胞プロセスを活性化する。これは、内皮細胞での NO 産生と VEGF 発現の増加と関連している。M3 のサイレンシング、または薬理学的 M3 阻害剤の使用によってこれらの効果がすべて消失したことから、DEET 誘導性血管新生は M3 感受性であることが示唆される。M3 受容体を過剰発現する内皮細胞と HEK 細胞のカルシウムシグナル伝達に関する実験、ならびに結合およびドッキング研究から、DEET は M3 受容体のアロステリック モジュレーターとして作用することが示されている。さらに、DEET は AChE を阻害することでアセチルコリンのバイオアベイラビリティと M3 受容体への結合を高め、アロステリック制御によって血管新生促進効果を高める。
初代培養細胞（EC）はスイスマウスの大動脈から単離された。抽出法は小林法26に準じた。マウスECは、5%の加熱不活化FBSを添加したEBM-2培地で4継代まで培養した。
CyQUANT細胞増殖アッセイキット（Molecular Probes社、C7026）を用いて、HUVEC、U87MG、またはBF16F10の増殖に対する2種類の濃度のDEETの影響を分析した。簡単に説明すると、96ウェルプレートに1ウェルあたり5.103個の細胞を播種し、一晩接着させた後、DEETで24時間処理した。増殖培地を除去した後、マイクロプレートの各ウェルに色素結合溶液を加え、37℃で30分間細胞をインキュベートした。蛍光レベルは、485 nm励起フィルターと530 nm蛍光フィルターを装備したMithras LB940マルチモードマイクロプレートリーダー（Berthold Technologies社、ドイツ、バート・ヴィルトバート）を用いて測定した。
HUVECを96ウェルプレートに1ウェルあたり104個の密度で播種した。細胞はDEETで24時間処理した。細胞生存率は、比色MTTアッセイ（Sigma-Aldrich、M5655）を用いて評価した。光学密度は、マルチモードマイクロプレートリーダー（Mithras LB940）を用いて、波長570 nmで測定した。
DEETの効果は、in vitro血管新生アッセイを用いて研究されました。10-8 Mまたは10-5 MのDEET処理により、HUVECにおける毛細血管長が増加しました（図1a、b、白線）。対照群と比較して、10-14 Mから10-5 MのDEET濃度で処理したところ、毛細血管長は10-8 M DEETでプラトーに達しました（補足図S2）。10-8 Mおよび10-5 Mの濃度範囲でDEET処理したHUVECのin vitro血管新生促進効果には有意差は認められませんでした。
DEETが新生血管形成に及ぼす影響を明らかにするため、in vivoでの新生血管形成研究を実施しました。14日後、10-8 Mまたは10-5 MのDEETで前培養した内皮細胞を注入したマウスでは、ヘモグロビン含量が有意に増加しました（図1c、白棒）。
さらに、DEET誘発性血管新生について、U87MG異種移植マウスに毎日腹腔内（ip）でDEETを投与し、血漿濃度を10-5 M（曝露を受けたヒトの正常値）に誘導する用量でDEETを投与した。U87MG細胞をマウスに投与してから14日後に、検出可能な腫瘍（腫瘍径100 mm³超）が観察された。28日目には、DEET投与マウスでは対照マウスと比較して腫瘍の増殖が有意に促進された（図1d、四角）。さらに、腫瘍のCD31染色により、DEETは毛細血管面積を有意に増加させたが、微小血管密度は増加させなかった（図1e～g）。
DETA誘導増殖におけるムスカリン受容体の役割を明らかにするため、pFHHSiD（10-7 M、選択的M3受容体拮抗薬）存在下で10-8 Mまたは10-5 MのDETAをHUVECに投与した。pFHHSiDは、全ての濃度においてDETAの増殖特性を完全に阻害した（表1）。
これらの条件下で、DEETがHUVEC細胞における毛細血管長を延長させるかどうかも検討しました。同様に、pFHHSiDはDEET誘導性の毛細血管長延長を有意に阻害しました（図1a、b、灰色のバー）。さらに、M3 siRNAを用いて同様の実験を行いました。対照siRNAは毛細血管形成を促進する効果はありませんでしたが、M3ムスカリン受容体のサイレンシングにより、DEETによる毛細血管長延長作用は消失しました（図1a、b、黒色のバー）。
さらに、10-8 Mまたは10-5 MのDEET誘導によるin vitro血管新生およびin vivo血管新生は、pFHHSiDによって完全に阻害されました（図1c、d、丸印）。これらの結果は、DEETが選択的M3受容体拮抗薬またはM3 siRNAに感受性のある経路を介して血管新生を促進することを示しています。
AChEはDEETの分子標的です。AChE阻害剤として作用するドネペジルなどの薬剤は、in vitroおよびマウス後肢虚血モデルにおいてECの血管新生を刺激することが報告されています14。HUVECにおけるAChE酵素活性に対する2濃度のDEETの影響を試験しました。低濃度（10-8 M）および高濃度（10-5 M）のDEETは、対照群と比較して内皮細胞のAChE活性を低下させました（図2）。
両濃度のDEET（10-8 Mおよび10-5 M）は、HUVECにおけるアセチルコリンエステラーゼ活性を低下させた。BW284c51（10-5 M）は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の対照として用いた。結果は、2濃度のDEETで処理したHUVECにおけるAChE活性を、溶媒処理した細胞と比較したパーセンテージとして表した。値は6回の独立した実験の平均値±SEMとして表した。*対照群と比較してp < 0.05（Kruskal-WallisおよびDunn多重比較検定）。
一酸化窒素（NO）は血管新生プロセスに関与していることが報告されているため33、DEET刺激を受けたHUVECにおけるNO産生について研究した。DEET処理した内皮細胞のNO産生は対照細胞と比較して増加したが、10-8 Mの用量でのみ有意に達した（図3c）。DEET誘導性NO産生を制御する分子変化を明らかにするため、eNOS発現および活性化をウェスタンブロッティングにより解析した。DEET処理はeNOS発現には変化を与えなかったものの、未処理細胞と比較して、eNOSリン酸化において活性化部位（Ser-1177）のeNOSリン酸化が有意に増加し、阻害部位（Thr-495）のeNOSリン酸化が減少した（図3d）。さらに、リン酸化eNOS量を酵素総量で正規化した後、活性化部位および阻害部位におけるリン酸化eNOSの比率を算出した。この比率は、各濃度のDEET処理を受けたHUVECにおいて、未処理細胞と比較して有意に増加した（図3d）。
最後に、主要な血管新生促進因子の一つであるVEGFの発現をウェスタンブロッティングで解析した。DEETはVEGFの発現を著しく増加させたが、pFHHSiDはこの発現を完全に阻害した。
DEETの効果は薬理学的阻害とM3受容体のダウンレギュレーションの両方に敏感であることから、DEETがカルシウムシグナル伝達を促進するという仮説を検証しました。驚くべきことに、DEETはHUVEC（データ未掲載）およびHEK/M3（図4a、b）において、いずれの濃度においても細胞質カルシウム濃度を増加させませんでした。
投稿日時: 2024年12月30日