駆虫薬N,N-ジエチル-m-トルアミド（ディートDEETはAChE（アセチルコリンエステラーゼ）を阻害し、過剰な血管新生により発がん性を持つ可能性があると報告されている。本論文では、DEETが血管新生を促進する内皮細胞を特異的に刺激し、それによって腫瘍の増殖を増加させることを示す。DEETは、増殖、遊走、接着など、血管新生につながる細胞プロセスを活性化する。これは、内皮細胞におけるNO産生とVEGF発現の増加と関連している。M3のサイレンシングまたは薬理学的M3阻害剤の使用により、これらの効果はすべて消失し、DEET誘導性血管新生がM3感受性であることを示唆している。M3受容体を過剰発現する内皮細胞およびHEK細胞におけるカルシウムシグナル伝達に関する実験、ならびに結合およびドッキング研究は、DEETがM3受容体のアロステリック調節因子として作用することを示している。さらに、DEETはAChEを阻害し、それによってアセチルコリンの生物学的利用能とM3受容体への結合を増加させ、アロステリック調節を介して血管新生促進効果を高める。
スイスマウスの大動脈から初代内皮細胞を分離した。抽出方法は小林プロトコル26を参考にした。マウス内皮細胞は、5%熱失活FBSを添加したEBM-2培地で4代目まで培養した。
HUVEC、U87MG、またはBF16F10の増殖に対する2つの濃度のDEETの影響は、CyQUANT細胞増殖アッセイキット（Molecular Probes、C7026）を使用して分析されました。簡単に説明すると、96ウェルプレートに1ウェルあたり5×10³個の細胞を播種し、一晩付着させた後、24時間DEETで処理しました。増殖培地を除去した後、マイクロプレートの各ウェルに色素結合溶液を加え、細胞を37℃で30分間インキュベートしました。蛍光レベルは、485 nm励起フィルターと530 nm発光フィルターを備えたMithras LB940マルチモードマイクロプレートリーダー（Berthold Technologies、ドイツ、バート・ヴィルトバート）を使用して測定しました。
HUVECを96ウェルプレートに1ウェルあたり10⁴個の密度で播種した。細胞をDEETで24時間処理した。細胞生存率は、比色MTTアッセイ（Sigma-Aldrich、M5655）を用いて評価した。吸光度値は、マルチモードマイクロプレートリーダー（Mithras LB940）を用いて波長570 nmで測定した。
DEETの効果は、in vitro血管新生アッセイを用いて検討した。10⁻⁸ Mまたは10⁻⁵ MのDEET処理により、HUVECにおける毛細血管長の形成が増加した（図1a、b、白色の棒グラフ）。対照群と比較して、10⁻¹⁴～10⁻⁵ Mの濃度範囲のDEET処理では、毛細血管長は10⁻⁸ MのDEETでプラトーに達した（補足図S2）。10⁻⁸ Mおよび10⁻⁵ Mの濃度範囲のDEETで処理したHUVECのin vitro血管新生促進効果に有意差は認められなかった。
DEETが血管新生に及ぼす影響を調べるため、生体内で血管新生に関する研究を行った。14日後、10⁻⁸ Mまたは10⁻⁵ MのDEETで前培養した内皮細胞を注射したマウスでは、ヘモグロビン含有量が有意に増加した（図1c、白い棒グラフ）。
さらに、DEET誘発性血管新生は、ヒトに曝露された場合に正常となる血漿濃度10⁻⁵ Mを誘導することが知られている用量のDEETを毎日腹腔内注射したU87MG異種移植マウスで研究された。23. U87MG細胞をマウスに注射してから14日後に検出可能な腫瘍（すなわち、100 mm³を超える腫瘍）が観察された。28日目には、DEET処理マウスでは対照マウスと比較して腫瘍の増殖が有意に促進された（図1d、四角）。さらに、腫瘍のCD31染色により、DEETは毛細血管面積を有意に増加させたが、微小血管密度は増加させなかったことが示された（図1e～g）。
DETA誘導増殖におけるムスカリン受容体の役割を決定するために、pFHHSiD（10⁻⁷ M、選択的M3受容体拮抗薬）存在下で10⁻⁸ Mまたは10⁻⁵ MのDETAを使用した。HUVECの処理。pFHHSiDは、すべての濃度でDETAの増殖特性を完全に阻害した（表1）。
これらの条件下で、DEETがHUVEC細胞の毛細血管長を増加させるかどうかについても検討した。同様に、pFHHSiDはDEET誘導性の毛細血管長を著しく阻害した（図1a、b、灰色の棒グラフ）。さらに、M3 siRNAを用いた同様の実験を行った。コントロールsiRNAは毛細血管形成を促進する効果はなかったが、M3ムスカリン受容体のサイレンシングはDEETによる毛細血管長増加能を消失させた（図1a、b、黒色の棒グラフ）。
さらに、in vitroでの10⁻⁸ Mまたは10⁻⁵ M DEET誘導血管新生とin vivoでの新生血管形成は、いずれもpFHHSiDによって完全に阻害された（図1c、d、円）。これらの結果は、DEETが選択的M3受容体拮抗薬またはM3 siRNAに感受性のある経路を介して血管新生を促進することを示している。
AChEはDEETの分子標的である。ドネペジルなどのAChE阻害剤として作用する薬剤は、in vitroおよびマウス後肢虚血モデルにおいてEC血管新生を刺激することができる14。我々はHUVECにおけるAChE酵素活性に対する2つの濃度のDEETの影響を試験した。低濃度（10⁻⁸ M）および高濃度（10⁻⁵ M）のDEETは、対照条件と比較して内皮AChE活性を低下させた（図2）。
DEETの2つの濃度（10⁻⁸ Mおよび10⁻⁵ M）は、HUVECのアセチルコリンエステラーゼ活性を低下させた。BW284c51（10⁻⁵ M）は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の対照として使用した。結果は、2つの濃度のDEETで処理したHUVECのAChE活性を、溶媒処理細胞と比較したパーセンテージで表した。値は、6回の独立した実験の平均±SEMで表した。*p < 0.05は対照と比較（Kruskal-WallisおよびDunn多重比較検定）である。
一酸化窒素（NO）は血管新生プロセスに関与しているため、DEET刺激HUVECにおけるNO産生を調べた。DEET処理した内皮細胞のNO産生は対照細胞と比較して増加したが、有意差が認められたのは10⁻⁸ Mの濃度のみであった（図3c）。DEET誘導性NO産生を制御する分子変化を明らかにするため、eNOSの発現と活性化をウェスタンブロッティングにより解析した。DEET処理はeNOSの発現を変化させなかったが、未処理細胞と比較して、活性化部位（Ser-1177）におけるeNOSのリン酸化を有意に増加させ、阻害部位（Thr-495）におけるリン酸化を減少させた（図3d）。さらに、リン酸化eNOSの量を酵素の総量で正規化した後、活性化部位と阻害部位におけるリン酸化eNOSの比率を算出した。この比率は、未処理細胞と比較して、各濃度のDEETで処理したHUVECで有意に増加した（図3d）。
最後に、主要な血管新生促進因子の一つであるVEGFの発現をウェスタンブロッティングにより解析した。DEETはVEGFの発現を著しく増加させたが、pFHHSiDはこの発現を完全に阻害した。
DEETの効果はM3受容体の薬理学的遮断とダウンレギュレーションの両方に影響を受けるため、DEETがカルシウムシグナル伝達を増強する可能性があるという仮説を検証した。驚くべきことに、DEETは使用した両方の濃度において、HUVEC（データは示していない）およびHEK/M3（図4a、b）の細胞質カルシウムを増加させなかった。
投稿日時：2024年12月30日
