農薬は、世界的な食糧不足への対処や、媒介動物が媒介するヒト疾患との闘いにおいて重要な役割を果たしています。しかし、農薬耐性の深刻化する問題により、十分に活用されていない標的を標的とする新規化合物の発見が緊急に求められています。昆虫の一過性受容体電位（TRPV）チャネルであるNanzhong（Nan）と不活性型（Iav）は、異種チャネル（Nan-Iav）を形成し、昆虫の地表屈性、聴覚、および固有受容を媒介する機械感覚器官に局在します。アフィドピロリドン（AP）などの一部の農薬は、未知のメカニズムでNan-Iavを標的とします。APは刺胞動物（半翅目）に対して効果があり、糸状体の機能を阻害することで摂食を阻害します。APはNanにのみ結合しますが、Nan-Iavのみが内因性ニコチンアミド（NAM）などのアゴニストと相互作用してチャネル活性を発揮します。 Nan-Iavは殺虫剤の標的となる可能性を秘めているものの、そのチャネル構築、調節結合部位、そしてCa2+依存性制御についてはほとんど解明されておらず、更なる殺虫剤開発の妨げとなっている。本研究では、クライオ電子顕微鏡を用いて、カルモジュリンリガンド非結合状態の半翅目昆虫におけるNan-Iavの構造、ならびにアンキリンリピート細胞質ドメイン（ARD）境界におけるAPおよびNAMの存在状態を解明した。驚くべきことに、Nanタンパク質自体が五量体を形成し、APを介したARD相互作用によって安定化されることがわかった。本研究は、殺虫剤およびアゴニストとNan-Iavとの分子間相互作用を明らかにし、チャネル機能と構築におけるARDの重要性を強調するとともに、Ca2+制御のメカニズムを探究するものである。
深刻化する地球規模の気候変動を背景に、世界の食糧安全保障の悪化は、社会に連鎖的な影響を及ぼしている 21 世紀の主要課題の 1 つです。1,2世界保健機関の「世界の食料安全保障と栄養の現状 2023 (SOFI)」報告書では、世界中で約 23 億 3000 万人が中程度から重度の食料不安に悩まされており、これは長年の問題であると推定されています。3,4残念なことに、害虫や病原菌によって毎年作物の収穫量の 20 ～ 30% 以上が失われていると推定されており、地球温暖化によって害虫耐性と作物の脆弱性が悪化すると予想されています。4,5,6,7,8農薬の開発は、作物を害虫から守り、媒介生物媒介病原体の拡散を抑えるだけでなく、デング熱、マラリア、シャーガス病など、農薬に対する耐性が高まっている媒介生物媒介性ヒト疾患と闘うためにも重要です。5,9,10,11
神経毒性殺虫剤の主な標的のうち、ヘテロ四量体 TRPV チャネル Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) は、イミダクロプリドやピラクロストロビンなどの市販の殺虫剤を含め、ここ 10 年で発見された殺虫剤標的のクラスを代表しています。12,13,14半合成殺虫剤アフィドピロリフェン (AP) は最近開発され商品化された製品で、その主成分はナノモル未満の活性レベルで AP に結合する活性殺虫剤 Inscalis® です。15AP は花粉媒介者、益虫、その他の非標的生物に対する急性毒性が低く、ラベルの指示に従って使用すると、他の殺虫剤に対する耐性圧力を軽減することができます。16,17,18Nan と Iav は昆虫種全体に広く分布しており、触角と四肢の索伸張受容体ニューロンでのみ共発現しており、聴覚、重力知覚、および固有受容に重要です。13,16,19,20,21,22AP、イミダクロプリド、ピラクロストロビンは、独自のメカニズムを通じて Nan-Iav 複合体を刺激し、最終的に固有受容シグナル伝達を阻害します。13,16,23アブラムシやコナジラミなどの刺して吸う昆虫（半翅目）では、固有受容感覚の喪失により摂食能力が低下し、最終的には死に至ります。13,24興味深いことに、APはNan-Iav複合体に対して高い親和性を示し、Nan単独に対しては低い親和性を示します。APがNan-Iavに結合すると電流が誘導されますが、Nan単独への結合ではチャネルの活性は刺激されません。Iav自体はAPに全く結合しません。16これは、NanとIavが結合して異なるNan-Iavチャネル複合体（例えば、異なる化学量論比、または同じ化学量論比内で異なる配置）を形成するか、APが複数の部位に結合する可能性があることを示唆しています。さらに、天然アゴニストであるニコチンアミド（NAM）は、ショウジョウバエのNan-Iavにマイクロモルレベルの親和性で結合し、in vitroにおいてアブラムシ（AP）と同様の作用を示します。16,25アブラムシの繁殖と摂食を阻害し、最終的には死に至らしめる。25,26これらのデータは多くの疑問を提起する。例えば、Nan-Iavヘテロダイマーがどのように形成されるのか、どの結合部位が小分子を調節するために用いられるのか、そしてこれらの小分子が固有受容感覚を抑制することでどのようにチャネル機能を制御するのかは、依然として不明である。さらに、Nan自体は不活性でAPに対する親和性が低いのに対し、Nan-Iavヘテロダイマーは活性でAPとより高い親和性で結合する理由も不明である。最後に、Ca2+依存性のNan-Iav機能制御と、それが神経シグナル伝達プロセスにどのように統合されるかについては、ほとんど分かっていない。13,21
本研究では、クライオ電子顕微鏡法、電気生理学、放射性リガンド結合法を組み合わせることで、Nan-Iavの組み立てと低分子調節因子への結合機構を解明しました。さらに、IavとAP安定化Nan五量体に恒常的に結合したカルモジュリン（CaM）を検出しました。これらの結果は、チャネルにおけるカルシウムイオンの調節、チャネルの組み立て、そしてリガンド結合親和性を決定する因子に関する重要な知見を提供します。さらに重要なことは、ARDがこれらのプロセスにおいて中心的な役割を果たしていることを確認したことです。関連する農薬に結合した完全な昆虫チャネルに関する研究27、28、29これにより、農薬産業の発展の見通しが開け、農薬の効能と特異性が向上し、TRPV を標的とした化合物を他の種に適用して、世界の食糧安全保障と媒介性疾患の蔓延に対処できるようになります。
また、Nan-IavはCa2+によって制御され、その制御機構は恒常的に結合したCaMによって媒介されることも明らかにしました。重要な点は、CaMによるこのCa2+依存的なNav制御は、他のイオンチャネル（例えば、電位依存性Na+チャネルやTRPV5/6チャネル）の制御機構とは大きく異なることです。52,53,54,55,56,57Nav1.2チャネルでは、CaMのC末端ドメインがC末端ドメイン（CTD）と螺旋状に会合し、Ca2+がN末端ドメインのCTD遠位部への結合を誘導する。56TRPV5/6チャネルでは、CaMのC末端ドメインがCTHに結合し、Ca2+がN末端ドメインの上方伸長を誘導して孔内に侵入し、陽イオン透過性を阻害する。53,54我々は、Nan-Iav-CaMのCa2+制御機能モデルを提案する（図4h）。このモデルでは、CaMのN末端ドメインがIavのC末端ドメイン（CTH）に恒常的に結合する。休止状態（低Ca2+濃度）では、CaMのC末端ドメインはNanと相互作用し、ARD構造を安定化させ、それによってチャネル開口を促進する。チャネルにアゴニスト／殺虫剤が結合すると、細孔が開き、Ca2+流入につながる。次にCa2+はCaMに結合し、NanのARDからC末端ドメインの解離を引き起こす。CaM結合を阻害するとCa2+の阻害効果が実質的に失われるため、この解離がARDの移動性を調節し、それによってCa2+依存性の阻害または脱感作を引き起こす。カルシウムイオン溶出後のチャネル電流の急速な回復（図4g）は、このメカニズムがCa2+を介した神経シグナルへの迅速な応答を促進することを示唆している。さらに、IavのC末端領域については未だ十分に解明されていないが、チャネル標的化と電流制御において他の役割を果たすことが報告されている。21
最後に、本研究では、農業上重要な殺虫剤-殺虫剤TRPチャネル複合体の高解像度構造を明らかにしました。これは、これまで我々が未知であった発見です。特筆すべきは、昆虫細胞ではなくヒト細胞（HEK293S GnTi-）において、この昆虫チャネルの構造と機能を解析したことです。殺虫剤耐性の増大と食料安全保障および病原体への継続的な圧力に直面している中、本研究は、人類の健康と世界の食料安全保障に貢献する新規殺虫剤の開発を促進する重要な情報を提供します。APなどの殺虫剤は、ラベルの指示に従って使用すれば一部の害虫に効果があり、益虫に対する急性毒性が低いことが研究で示されており、環境安全性が実証されています。13,16さらに、いくつかのAP誘導体を蚊に投与した試験では、蚊が最終的に飛翔能力を失うことが示されています。これらの調節化合物がNan-Iavとどのように結合するかを理解することで、既存の化合物の改良や、より効果的で効果的な新規化合物の開発が促進されます。正確な害虫防除。本研究は、Nan-Iav ARDインターフェースが、内因性化合物、農薬、およびCa2+-CaMの活性制御だけでなく、チャネルの組み立てにも重要であることを示しています。低分子化合物によるヘテロ二量体組み立ての阻害は、イオンチャネル阻害剤開発のための独自の有望なアプローチとなる可能性を示唆しています。
8つの相同遺伝子のうち、界面活性剤に対する優れた安定性を示す、褐色甲虫（Halyomorpha halys）NanchungおよびInactiveの全長遺伝子が選択された。合成された遺伝子はヒト発現用にコドン最適化され、XhoIおよびEcoRI制限酵素部位を用いてpBacMam pCMV-DESTベクター（Life Technologies社製）にクローニングされた。これにより、クローンはC末端のGFP-FLAG-10xHisおよびmCherry-FLAG-10xHisタグとインフレームであることが保証され、これらのタグはHRC-3Cプロテアーゼ（PPX）によって切断され、独立した転写開始点が確保された。表現NanchungとInactiveをpBacMamベクターにクローニングするために使用したプライマーは次のとおりです。
個々の粒子の顕微鏡画像は、K3カメラとGatan BioQuantumエネルギーフィルターを搭載したTitan Krios G2透過型電子顕微鏡（FEI）を用いて取得しました。顕微鏡は300 keV、エネルギー設定20 eV、サンプルピクセルサイズ1.08 Å/ピクセル（公称倍率81,000倍）、デフォーカス勾配-0.8～-2.2 μmで動作しました。ビデオ録画は、Latitude S顕微鏡（Gatan）を用いて、公称線量率25 e–px−1 s−1、露光時間2.4秒、総線量約60 e–Å−2で毎秒40フレームの速度で実施しました。
RELION 4.061 の MotionCor2 を使用して、フィルム上でビーム誘起運動補正および線量加重を実施しました。コントラスト伝達関数 (CTF) パラメータ推定は、パッチベース CTF 推定法62 を使用して cryoSPARC で実施しました。CTF フィッティング解像度が 4 Å 以上の顕微鏡写真は、以降の解析から除外しました。通常、500～1000 枚の顕微鏡写真のサブセットを使用して cryoSPARC で点選択を行い、続いてフィルタリング後に 2D 分類を複数回実行して、テンプレートベースの粒子選択用の明確な参照画像を取得しました。次に、64 ピクセルの境界ボックスと 4 倍のビニングを使用して粒子を抽出しました。不要な粒子カテゴリを除去するために、2D 分類を複数回実行しました。最初の 3D モデルは、ab initio 再構成を使用して再構築され、cryoSPARC で非均一改良を使用して改良されました。3D 分類は、ARD の不均一性に基づいて cryoSPARC または RELION で実行されました。膜ドメインの顕著な不均一性は観察されませんでした。粒子はC1法とC2法を用いて精製された。C2法の解像度が高い粒子はC2法に対して対称であるとみなされ、ベイズ法による精製のためにRELIONにインポートされた。その後、粒子はcryoSPARCに再転送され、最終的な非均一性と局所性を考慮した精製が行われた。最終的な解像度と粒子数は表1に示す。
Nan+APペンタマーの処理において、シグナル減算やTMDマスキングなど、膜ドメイン（特に細孔領域）の解像度を向上させる様々な手法を検討しました。しかし、これらの試みは、細孔領域の潜在的な極端な無秩序性とTMD全体の不均一性のために成功しませんでした。最終的な解像度は、cryoSPARCの非均一処理法によって自動生成されたマスクを用いて計算され、主にARD領域を対象としました。これにより、膜ドメイン（特にVSLD領域）の解像度を大幅に上回る解像度が得られました。
NanchungバグおよびInactiveバグのアポ型の初期de novoモデルは、まずCoot63を用いて生成され、次にNanバグおよびIavバグのモデルは、信頼性の低い領域を特定するためにAlphaFold264を用いて生成された。カルモジュリンモデリングは、それぞれPDBアクセッション番号4JPZ56および1CFD65のCa2+結合モデルおよびCa2+非結合モデルの剛体フィッティングに基づいて行われた。これらのモデルは、正しい立体化学と良好な形状を確保するために、球面リファインメントを用いてリファインされた。次に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルセリンを明確に定義された脂質密度としてモデル化し、NAMおよびAPリガンドをタイトジャンクション内の対応する密度に配置した。PHENIX66のeLBOWを用いて、アイソフォームのSMILES文字列から制約ファイルを生成した。最後に、PHENIXを用いて、局所グリッドサーチと二次構造制約を用いた大域的最小化を用いて、実空間におけるモデルの精密化を行った。モデルの精密化と構造解析にはMolProbityサーバーを使用し、図解はPyMOLとUCSF Chimera Xを用いて行った67,68,69。アパーチャー解析はHOLEサーバーを用いて行い、70 配列保存マッピングはConsurfサーバーを用いて行った71。
統計解析はIgor Pro 6.2、Excel Office 365、GraphPad Prism 7.0を用いて実施しました。すべての定量データは平均値±標準誤差（SEM）として示しています。2群間の比較には、スチューデントt検定（両側、無対比）を用いました。多群間の比較には、一元配置分散分析（ANOVA）とDunnettの事後検定を用いました。*P< 0.05、**P< 0.01、***P0.001未満は、データ分布に応じて統計的に有意であると判断されました。Kd値、Ki値、およびそれらの非対称95%信頼区間は、GraphPad Prism 10を使用して計算されました。
研究方法の詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Report Summary をご覧ください。
初期モデルは、PDB 4JPZおよび1CFDデータベースのカルモジュリンモデルを用いて構築されました。座標は、タンパク質データバンク（PDB）に、アクセッション番号9NVN（リガンド非結合Nan-Iav-CaM）、9NVO（ニコチンアミド結合Nan-Iav-CaM）、9NVP（ニコチンアミドおよびEDTA結合Nan-Iav-CaM）、9NVQ（アフェニドルピロリンおよびカルシウム結合Nan-Iav-CaM）、9NVR（アフェニドルピロリンおよびEDTA結合Nan-Iav-CaM）、および9NVS（アフェニドルピロリン結合Nanペンタマー）として登録されています。対応するクライオ電子顕微鏡画像は、電子顕微鏡データベース（EMDB）に以下のアクセッション番号で登録されています：EMD-49844（リガンドを含まないNan-Iav-CaM）、EMD-49845（ニコチンアミドを含むNan-Iav-CaM複合体）、EMD-49846（ニコチンアミドおよびEDTAを含むNan-Iav-CaM複合体）、EMD-49847（アフィドピロリンおよびカルシウムを含むNan-Iav-CaM複合体）、EMD-49848（アフィドピロリンおよびEDTAを含むNan-Iav-CaM複合体）、およびEMD-49849（アフィドピロリンを含むNan五量体複合体）。本論文では、機能解析のための生データを提示します。
投稿日時: 2026年1月28日