殺虫剤は、世界的な食糧不足への対処や媒介動物を介して伝染するヒトの病気との闘いにおいて重要な役割を果たしている。しかし、殺虫剤耐性の増大という問題により、これまで十分に活用されてこなかった標的を狙う新たな化合物の発見が喫緊の課題となっている。昆虫の一過性受容体電位（TRPV）チャネルであるナンジョン（Nan）と不活性（Iav）は、異種チャネル（Nan-Iav）を形成し、昆虫の重力屈性、聴覚、固有受容を媒介する機械受容器官に局在する。アフィドピロリドン（AP）などの一部の殺虫剤は、未知のメカニズムによってNan-Iavを標的とする。APは、吸汁性昆虫（半翅目）に対して有効であり、フィラメントの機能を阻害することで摂食を阻害する。APはNanにのみ結合するが、Nan-Iavのみが内因性ニコチンアミド（NAM）などのアゴニストと相互作用し、チャネル活性を示すことができる。 Nan-Iavは殺虫剤の標的として有望であるにもかかわらず、そのチャネルの組み立て、調節結合部位、およびCa2+依存性調節についてはほとんど知られておらず、殺虫剤開発の妨げとなっている。本研究では、クライオ電子顕微鏡を用いて、半翅目昆虫におけるNan-Iavの構造を、カルモジュリンリガンド非結合状態、およびアンキリンリピート細胞質ドメイン（ARD）の境界にAPとNAMが存在する状態で決定した。驚くべきことに、Nanタンパク質自体が五量体を形成し、それがAPを介したARD相互作用によって安定化されることがわかった。本研究は、殺虫剤およびアゴニストとNan-Iavとの間の分子間相互作用を明らかにし、チャネルの機能と組み立てにおけるARDの重要性を強調し、Ca2+調節のメカニズムを探求するものである。
地球規模の気候変動がますます深刻化する中で、世界的な食料安全保障の悪化は21世紀における主要な課題の一つであり、社会に連鎖的な影響を及ぼす。1,2世界保健機関（WHO）の「世界の食料安全保障と栄養の現状2023（SOFI）」報告書によると、世界中で約23億3000万人が中程度から重度の食料不安に苦しんでおり、これは長年にわたる問題であると推定されている。3,4残念ながら、毎年推定20％から30％以上が害虫や病原菌によって失われており、地球温暖化によって害虫の抵抗力と作物の脆弱性がさらに悪化すると予想されている。4、5、6、7、8農薬の開発は、作物を害虫から守り、媒介生物によって媒介される病原体の蔓延を抑えるだけでなく、デング熱、マラリア、シャーガス病など、農薬に対する耐性が高まっている媒介生物によって媒介されるヒトの病気と闘うためにも不可欠である。5、9、10、11
神経毒性殺虫剤の主要な標的の中で、ヘテロ四量体TRPVチャネルであるナンチュン（ナン）-不活性（Iav）は、イミダクロプリドやピラクロストロビンなどの市販の殺虫剤を含め、ここ10年以内に発見された殺虫剤の標的群を代表するものである。12、13、14半合成殺虫剤アフィドピロリフェン（AP）は、最近開発され商品化された製品であり、その主成分は活性殺虫剤Inscalis®で、APをサブナノモル濃度の活性レベルで結合する。15APは、花粉媒介昆虫、益虫、その他の非標的生物に対する急性毒性が低く、ラベルの指示に従って使用すれば、他の殺虫剤に対する耐性圧力を軽減することができる。16、17、18NanとIavは昆虫種全体に広く分布しており、触角と四肢の索状伸展受容ニューロンでのみ共発現し、聴覚、重力知覚、固有受容感覚に不可欠である。13、16、19、20、21、22AP、イミダクロプリド、ピラクロストロビンは、独自のメカニズムを介してNan-Iav複合体を刺激し、最終的に固有受容感覚シグナル伝達を阻害する。13、16、23アブラムシやコナジラミなどの刺吸性昆虫（半翅目）では、固有受容感覚の喪失は摂食能力を損ない、最終的には死に至る。13,24興味深いことに、APはNan-Iav複合体に対して高い親和性を示し、Nan単独に対しては低い親和性を示す。APがNan-Iavに結合すると電流が発生するが、Nan単独への結合ではチャネル活性は刺激されない。Iav自体はAPに全く結合しない。16これは、NanとIavが結合して異なるNan-Iavチャネル複合体（例えば、異なる化学量論比、あるいは同じ化学量論比内での異なる配置）を形成する可能性、またはAPが複数の部位に結合する可能性を示唆している。さらに、天然アゴニストであるニコチンアミド（NAM）は、ショウジョウバエのNan-Iavにマイクロモル濃度の親和性で結合し、試験管内でアブラムシ（AP）と同様の効果を示す。16,25アブラムシの繁殖と摂食を阻害し、最終的には死に至らしめる。25,26これらのデータは多くの疑問を提起する。例えば、Nan-Iavヘテロ二量体がどのように形成されるのか、どの結合部位が小分子の調節に用いられるのか、そしてこれらの小分子が固有受容感覚を抑制することでどのようにチャネル機能を調節するのかは依然として不明である。さらに、Nan自体は不活性でAPに対する親和性が低いのに対し、Nan-Iavヘテロ二量体は活性でAPに高い親和性で結合する理由は不明である。最後に、Nan-Iav機能のCa2+依存性調節と、それが神経シグナル伝達プロセスにどのように組み込まれているかについてはほとんど分かっていない。13,21
本研究では、クライオ電子顕微鏡、電気生理学、放射性リガンド結合技術を組み合わせることにより、Nan-Iavの集合と、それが低分子調節因子に結合するメカニズムを解明しました。さらに、IavとAPで安定化されたNanペンタマーに恒常的に結合したカルモジュリン（CaM）を検出しました。これらの結果は、チャネルにおけるカルシウムイオンの調節、チャネルの集合、およびリガンド結合親和性を決定する因子に関する重要な知見を提供します。さらに重要なことに、ARDがこれらのプロセスにおいて中心的な役割を果たしていることを確認しました。関連する農薬に結合した完全な昆虫チャネルの研究27、28、29これは、殺虫剤産業の発展の可能性を広げ、殺虫剤の有効性と特異性を向上させ、TRPVを標的とした化合物を他の生物種にも適用することを可能にし、世界の食糧安全保障と媒介性疾患の蔓延に対処することを可能にする。
また、Nan-IavはCa2+によって調節され、その調節機構は恒常的に結合したCaMによって媒介されることも判明した。重要なことに、CaMによるNavのこのCa2+依存性調節は、他のイオンチャネル（例えば、電位依存性Na+チャネルやTRPV5/6チャネル）の調節機構とは大きく異なっている。52,53,54,55,56,57Nav1.2チャネルでは、CaMのC末端ドメインがC末端ドメイン（CTD）とらせん状に結合し、Ca2+はN末端ドメインをCTDの遠位部分に結合させる。56TRPV5/6チャネルでは、CaMのC末端ドメインがCTHに結合し、Ca2+によってN末端ドメインがチャネル孔内に上方に伸長し、カチオン透過が阻害される。53,54我々は、Nan-Iav-CaMのCa2+調節機能のモデルを提案する（図4h）。このモデルでは、CaMのN末端ドメインは、IavのC末端ドメイン（CTH）に恒常的に結合している。静止状態（低[Ca2+]濃度）では、CaMのC末端ドメインがNanと相互作用し、ARDコンフォメーションを安定化させ、それによってチャネル開口を促進する。アゴニスト/殺虫剤がチャネルに結合すると、ポアが開口し、Ca2+流入が起こる。次にCa2+がCaMに結合し、NanのARDからC末端ドメインが解離する。CaM結合を阻害するとCa2+の阻害効果がほぼ完全に消失するため、この解離はARDの可動性を調節し、それによってCa2+依存性阻害または脱感作を引き起こす。カルシウムイオン溶出後のチャネル電流の急速な回復（図4g）は、このメカニズムがCa2+を介した神経シグナルへの迅速な応答を促進することを示唆している。さらに、まだ十分に解明されていないIavのC末端領域は、チャネルの標的化と電流調節において他の役割を担っていることが報告されている。21
最後に、本研究では、これまで知られていなかった、農業上重要な殺虫剤-殺虫剤TRPチャネル複合体の高解像度構造を提示します。特筆すべきは、昆虫細胞ではなくヒト細胞（HEK293S GnTi–）で昆虫チャネルの構造と機能を特徴づけたことです。殺虫剤耐性の増大と食料安全保障および病原体への継続的な圧力に直面する中で、本研究は、人間の健康と世界の食料安全保障に利益をもたらす新しい殺虫剤の開発を促進する重要な情報を提供します。研究により、APなどの殺虫剤はラベルの指示に従って使用すれば一部の害虫に効果があり、有益な花粉媒介者に対する急性毒性が低いことが示されており、環境安全性が実証されています。13,16さらに、蚊に対するいくつかのAP誘導体の試験では、蚊が最終的に飛ぶ能力を失うことが示されています。これらの調節化合物がNan-Iavにどのように結合するかを理解することで、既存の化合物の修正や、より効果的で新しい化合物の開発が容易になります。正確な害虫駆除。本研究は、Nan-Iav ARD界面が、内因性化合物、農薬、およびCa2+-CaMの活性調節だけでなく、チャネル集合にも重要であることを示しています。低分子を用いてヘテロ二量体集合を阻害することは、イオンチャネル阻害剤開発のためのユニークで有望なアプローチとなる可能性があると考えられます。
8つの相同遺伝子のうち、洗剤に対する優れた安定性を示したチャバネコガネ（Halyomorpha halys）のNanchungとInactiveの全長遺伝子を選択した。合成した遺伝子はヒト発現用にコドン最適化し、XhoIおよびEcoRI制限酵素部位を用いてpBacMam pCMV-DESTベクター（Life Technologies）にクローニングした。これにより、クローンがC末端のGFP-FLAG-10xHisおよびmCherry-FLAG-10xHisタグとインフレームになることが保証され、これらのタグはHRC-3Cプロテアーゼ（PPX）によって切断され、独立した表現NanchungとInactiveをpBacMamベクターにクローニングするために使用したプライマーは以下のとおりです。
個々の粒子の顕微鏡画像は、K3 カメラと Gatan BioQuantum エネルギーフィルターを備えた Titan Krios G2 透過型電子顕微鏡 (FEI) で取得しました。顕微鏡は 300 keV で動作し、エネルギー設定は 20 eV、サンプル ピクセル サイズは 1.08 Å/ピクセル (公称倍率 81,000 倍)、デフォーカス勾配は -0.8 ～ -2.2 μm の範囲でした。ビデオ録画は、Latitude S 顕微鏡 (Gatan) を使用して 40 フレーム/秒で実行され、公称線量率は 25 e–px−1 s−1、露光時間は 2.4 秒、総線量は約 60 e–Å−2 でした。
RELION 4.061 の MotionCor2 を使用してフィルム上でビーム誘起モーション補正と線量加重を実行した。コントラスト伝達関数 (CTF) パラメータ推定は、cryoSPARC でパッチベースの CTF 推定法 62 を使用して実行した。CTF フィッティング解像度が 4 Å 以上の顕微鏡写真は、その後の解析から除外した。通常、cryoSPARC でポイント選択に 500 ～ 1000 枚の顕微鏡写真のサブセットを使用し、フィルタリング後に数回の 2D 分類を実行して、テンプレートベースの粒子選択のための明確な参照画像を得た。次に、64 ピクセルのバウンディング ボックスと 4 分割ビニングを使用して粒子を抽出した。不要な粒子カテゴリを除去するために、数回の 2D 分類を実行した。最初の 3D モデルは、ab initio 再構成を使用して再構築し、cryoSPARC で非均一な精密化を使用して精密化した。3D 分類は、ARD の不均一性に基づいて、cryoSPARC または RELION で実行した。膜ドメインの有意な不均一性は観察されなかった。粒子はC1法とC2法を用いて精製された。C2分解能の高い粒子はC2に関して対称であるとみなされ、ベイズ精製のためにRELIONにインポートされた。その後、粒子は最終的な不均一および局所精製のためにcryoSPARCに戻された。最終的な分解能と粒子数は表1に示されている。
Nan+APペンタマーの処理において、シグナル減算やTMDマスキングなど、膜ドメイン（特にポア領域）の解像度を向上させるための様々な方法を検討しました。しかし、ポア領域の極めて大きな構造的不均一性とTMD全体の不均一性のため、これらの試みは成功しませんでした。最終的な解像度は、cryoSPARCの非均一処理法によって自動的に生成されたマスク（主にARD領域をターゲットとする）を使用して算出しました。これにより、膜ドメイン（特にVSLD領域）の解像度よりも大幅に高い解像度が得られました。
ナンチュンおよび不活性バグのアポ型の初期de novoモデルは、まずCoot63を使用して生成され、NanおよびIavバグのモデルは、信頼性の低い領域を特定するためにAlphaFold264を使用して生成されました。カルモジュリンのモデリングは、それぞれPDBアクセッション4JPZ56および1CFD65のCa2+結合モデルおよびCa2+非結合モデルの剛体フィットに基づいて行われました。モデルは、正しい立体化学と良好な形状を確保するために、球状精密化を使用して精密化されました。次に、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルセリンは、明確に定義された脂質密度としてモデル化され、NAMおよびAPリガンドはタイトジャンクションの対応する密度に配置されました。制約ファイルは、PHENIX66のeLBOWを使用して、アイソフォームのSMILES文字列から生成されました。最後に、PHENIXを用いて、二次構造制約を用いた局所グリッドサーチとグローバル最小化により、実空間でモデルを精密化した。モデルの精密化と構造解析にはMolProbityサーバーを使用し、図解はPyMOLとUCSF Chimera Xを用いて行った。67,68,69 アパーチャ解析はHOLEサーバー70を用いて行い、配列保存マッピングはConsurfサーバー71を用いて行った。
統計解析は、Igor Pro 6.2、Excel Office 365、およびGraphPad Prism 7.0を用いて実施した。すべての定量的データは平均値±標準誤差（SEM）で示した。2群間の比較には、スチューデントのt検定（両側検定、対応なし）を用いた。多群間の比較には、一元配置分散分析（ANOVA）に続いてダネットの事後検定を用いた。*P< 0.05、**P< 0.01、および***Pデータの分布に応じて、p<0.001を統計的に有意とみなした。Kd、Ki値、およびそれらの非対称95%信頼区間はGraphPad Prism 10を使用して計算した。
研究方法の詳細については、この記事にリンクされているNature Portfolioレポートの概要をご覧ください。
初期モデルは、PDB 4JPZおよび1CFDデータベースのカルモジュリンモデルを使用して構築されました。座標は、タンパク質データバンク（PDB）に、アクセッション番号9NVN（リガンドなしのNan-Iav-CaM）、9NVO（ニコチンアミドに結合したNan-Iav-CaM）、9NVP（ニコチンアミドとEDTAに結合したNan-Iav-CaM）、9NVQ（アフェニドルピロリンとカルシウムに結合したNan-Iav-CaM）、9NVR（アフェニドルピロリンとEDTAに結合したNan-Iav-CaM）、および9NVS（アフェニドルピロリンに結合したNanペンタマー）で登録されています。対応するクライオ電子顕微鏡画像は、電子顕微鏡データベース（EMDB）に以下の登録番号で登録されています：EMD-49844（リガンドなしのNan-Iav-CaM）、EMD-49845（ニコチンアミドとのNan-Iav-CaM複合体）、EMD-49846（ニコチンアミドとEDTAとのNan-Iav-CaM複合体）、EMD-49847（アフィドピロリンとカルシウムとのNan-Iav-CaM複合体）、EMD-49848（アフィドピロリンとEDTAとのNan-Iav-CaM複合体）、およびEMD-49849（アフィドピロリンとのNan五量体複合体）。機能解析の生データは本論文で提示されています。
投稿日時：2026年1月28日
